NOT: Tamponlar 0,22 μm'lik bir filtre kullanılarak filtrelenmeli ve 1 saat boyunca bir vakumla gazı alınmalıdır.
1. Lipid Vezikül Hazırlama
- 2 mL'lik cam tüpler kullanın. Her bir lipidi, 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (POPS) ve kolesterolü (Chol), berrak bir 5 mM lipid çözeltisi hazırlamak için kloroform/metanol (50:50 v/v) karışımı içinde çözün. 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-(1'-myo-inositol-4',5'-bifosfat) (PI(4,5)P2) kloroform/metanol/su karışımı (20:9:1 v/v) içinde çözün.
- Çözünmüş lipitleri POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20) ve POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (Tablo 1) 10 mL cam tüplerde istenen molar oranda birleştirin.
not: Toplam lipidin nihai miktarı 500 μg'dır.
- Organik çözücüleri kuru bir nitrojen akışı kullanarak buharlaştırın. Solvent kalıntılarını gidermek için lipid karışımını yüksek vakumlu (liyofilizasyon) bir sistemde 3 saat bekletin.
not: Bu, kuru ve şeffaf bir film ile sonuçlanır.
- Lipid filmi 1 mL sitrat tamponunda (10 mM trisodyum-sitrat, 150 mM NaCl, pH 4.6) yeniden süspanse edin. Lipid süspansiyonunu 60 ° C'de (bu sıcaklık, karışımdaki en yüksek eriyen lipidin faz geçiş sıcaklığının yaklaşık 10 °C üzerindedir) bir su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin ve her 5 dakikada bir kuvvetlice girdap < / >
not: Bu, büyük, çok katmanlı veziküllerin (MLV'ler) oluşumuna neden olur. Süspansiyonu geçiş sıcaklığının üzerinde tutun.
- 50 nm çapında gözenek boyutunda bir polikarbonat membran ile donatılmış ekstrüderi (bu durumda 60 °C'de) geçiş sıcaklığının (burada 40 - 50 °C'dir) üzerinde 30 dakika önceden ısıtın.
- MLV süspansiyonunu önceden ısıtılmış ekstrüdere yükleyin ve küçük tek taraflı veziküller (SUV'lar) oluşturmak için karışımı 31x polikarbonat membrandan yavaşça geçirin. Sıcaklığı geçiş sıcaklığının üzerinde tutun.
- SUV süspansiyonunu 2 mL'lik bir plastik reaksiyon kabına aktarın ve nihai hacmi 2 mL.
'ye getirmek için sitrat tamponunu ekleyin (bkz. adım 1.4)
not: Bu, 250 μg/mL'lik bir nihai lipit konsantrasyonu verecektir.
2. Kuvars Sensörlerinin Kullanımı
NOT: Kuvars sensörlerini her zaman bir cımbızla tutun.
Bir - politetrafloroetilen tutucuya yerleştirilen dört sensörü %2'lik bir SDS çözeltisinde ≥ 30 dakika inkübe edin. SDS'yi tamamen çıkarmak için ultra saf suyla iyice yıkayın ve kuru argon veya nitrojen akışı kullanarak kurumaya bırakın.
- Kirleticileri tamamen gidermek için bir plazma temizleme sistemi kullanın. Kuru sensörleri plazma temizleme haznesine yerleştirin, hazneyi boşaltın ve 3 kez oksijenle yıkayın. Plazma temizleyiciyi açın. Aşağıdaki işlem parametrelerini kullanın: 1 x 10-4 Torr basıncı, yüksek radyo frekansı (RF) gücü ve 10 dakikalık işlem süresi. Makineyi kapatın ve sensörleri çıkarın.
3. Mikro Terazi İşlemi
>NOT: Peristaltik bir pompaya bağlı ve 80 μL/dk akış hızına ayarlanmış, paralel konfigürasyonda dört sıcaklık kontrollü akış odasına sahip bir mikro terazi sistemi kullanılmıştır. Açık akış modunda, tampon besleyici rezervuarından alıcı tanka pompalandı. Döngü modunda, alıcı tank, kapalı bir döngü oluşturmak için besleyici rezervuarına bağlandı. Sıcaklık 20 °C'ye ayarlandı.
- Plazma ile temizlenmiş sensörleri cımbız kullanarak 4 akış odasına dikkatlice yerleştirin. Sızıntıya neden olabilecek hazneler ve tüpler üzerinde herhangi bir baskı veya burulmadan kaçının.
- Sistemi sitrat tamponu (10 mM trisodyum-sitrat, 150 mM NaCl, pH 4.6) ile açık akış modunda 10 dk.
not: Bu tam olarak 3.2 mL tampon gerektirir, ancak fazla tampon (10 mL) kullanılması tavsiye edilir.
- Programı başlatın. Frekans ve dağılım taban çizgileri sabit olana kadar (bu yaklaşık 40 - 60 dakika sürecektir) yazılımı kullanarak ilk temel tonun (n = 1.) ve üst tonların (n = 3. - 13.) frekansı ve dağılımındaki değişiklikleri kaydetmeye başlayın.
not: Frekans gürültü seviyeleri (tepeden tepeye) 0,5 Hz'den düşük ve dağılım için 0,1·10-6'dan düşük olmalı, frekansta 1 Hz/s ve dağılımda 0,3·10-6/s'lik bir maksimum sapma (sulu çözelti içinde) olmalıdır.
- Taban çizgileri stabil olduğunda, SUV süspansiyonunu sitrat tamponunda (küçük bir tüpte 2 mL) uygulayın. Bir reaksiyon kabı kullanarak, ölü hacmin 1.5 mL'sini çıkarın. Ardından sistemi döngü akış modunda kapatın. Frekans/dağılım vardiyasını 10 dakika daha kaydedin.
not: Bu süre zarfında, veziküllerSiO2 yüzeyine yayılacak ve sürekli bir çift tabaka oluşturmak için birleşecektir (Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3'teki adım 2). Sensörün yüzeyindeki SUV adsorpsiyonu iki fazlıdır ve dağılımda minimum ve maksimum tipik bir frekansa sahiptir. 26 - 29 Hz arasında karakteristik bir frekans kayması (lipid bileşimine bağlı olarak) ile kararlı yeni bir frekans/dağılım taban çizgisi (bkz. Tablo 1), yüzeyde sürekli bir çift tabakayı gösterir.
- SLB stabil olduğunda (bkz. adım 3.4), sistemi çalışma tamponu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4) ile gerekli Ca2+ konsantrasyonlarında (deneye bağlı olarak 50 μM ila 1 mM CaCl2 arasında değişir) 40 dakika boyunca açık akış modunda dengeleyin.
- Proteini (burada, AnxA2) Ca2+ içeren çalışan tampona ekleyin (bkz. adım 3.5). Proteinin uygulamasını, kararlı bir denge durumuna ulaşılana kadar bir döngü akış modunda gerçekleştirin (Şekil 1, Şekil 2 ve Şekil 3'teki adım 3).
not: Protein konsantrasyonu 1 ila 400 nm arasında değişebilir. Protein adsorpsiyonu, kütle (protein) adsorpsiyonunu yansıtan konsantrasyona bağlı bir frekans kayması ile sonuçlanır.
- Açık akış modunda çalışan tamponda Ca2+ iyonlarını 5 mM EGTA ile şelatlayarak bağlı proteini ayırın (Şekil 1 ve Şekil 2'de adım 4).
not: Frekansın geri kazanılması ve SLB taban çizgisine yayılması, protein bağlanmasının toplam tersine çevrilebilirliğini gösterir. Farklı konsantrasyonları veya proteinleri karşılaştırmak için birleşme-ayrışma döngüleri tekrarlanabilir.
