Yöntem makalesi

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Zuo, L. et al., DNA Üzerinde EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi. (2021)

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. DNA Perdelerinde EWS-FLI1 yoğunlaşma oluşumunun görüntülenmesi

  1. Görüntüleme yazılımını açın, parlak alanın altındaki 3 × 3 zikzak desenlerinin konumlarını bulun ve işaretleyin.
  2. DNA'yı çift sarmallı DNA boyası ile 10 dakika boyunca boyamak için akışı 0,2 mL / dk'da açın.
  3. mCherry-EWS-FLI1'i görüntüleme tamponu ile tüpte 100 μL'de 100 nM konsantrasyonuna kadar seyreltin.
  4. Protein örneğini 100 μL'lik bir cam şırınga ile valften yükleyin ve akış hızını 0,4 mL/dk olarak değiştirin.
  5. 488 nm lazeri açın ve DNA dağılım durumunu kontrol etmek için her bölgeyi önceden tarayın; DNA moleküllerinin eşit olarak dağıldığı bölgeyi seçin. Lazer gücünü 488 nm lazer için %10 ve 561 nm lazer için %20'ye ayarlayın. Prizmanın yakınındaki gerçek lazer gücünü ölçmek için güç ölçeri kullanın: 488 nm lazer için 4,5 mW ve 561 nm lazer için 16,0 mW.
  6. Görüntü elde etme
      Aynı
    1. anda hem 488 nm hem de 561 nm lazerlerle 2 sn aralıklarla görüntü almaya başlayın.
    2. Görüntüleme tamponunun protein örneğini 60 s.
      sonra akış hücresine akıtmasına izin vermek için valfi manuel moddan enjeksiyon moduna değiştirin not: Bu işlem ~ 30 s sürecek ve EWS-FLI1 proteinleri akış hücresine ulaşır ulaşmaz görüş alanı mCherry sinyalleri ile kaplanacaktır.
    3. Serbest EWS-FLI1'i çıkarmak için, yalnızca 5 nm lazer açıkken akış hücresini görüntüleme tamponu ile 561 dakika boyunca yıkamaya devam edin. Akışı durdurun ve 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
    4. DNA'nın uzamasına izin vermek için akışı 0,4 mL / dk'da açın ve EWS-FLI1 kondensat oluşumunun yüksek verimli verilerini elde etmek için farklı çerçeveler arasında 2 s aralıklarla görüntüler elde edin.

2. mCherry-EWS-FLI1 için yoğunluk analizi

  1. Verileri görüntü dizileri olarak ImageJ yazılımına aktarın, 8×8 piksellik bir karede 25× GGAA sitelerinde puncta'yı seçin ve görüntüyü .tif formatında kaydedin.
  2. Yoğunluğu, tüm punkta dahil olmak üzere 8×8 piksel karedeki yoğunluğun toplamı olarak hesaplayın ve 8x8 piksel kareye yakın aynı boyutta bir alanda arka planın yoğunluğunu çıkararak arka planı kaldırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
488 nm diyot pompalı katı hal lazeriyapışıkOBIS488LS
561 nm diyot pompalı katı hal lazeriyapışıkOBIS561LS
Nikon Ters MikroskopNikonTutulma Ti
PMMA (Başbakanlık)PMMA (Başbakanlık)Başbakan95B

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

F zyon ProteinleriFloresan MikroskopiMikroak kan SistemAk H cresiDNA Ba lanmasLazer G r nt lemeKondensat Montaj

İlgili makaleler