Yöntem makalesi

Protein-Fosfoinositid Etkileşimlerini Tespit Etmek için Desteklenen Lipid Çift Katmanları Üzerinde pH Modülasyon Testi

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Shengjuler, D., et al., PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimleri Üzerine Etiketsiz Bir Çalışma. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, mikroakışkan platform adı verilen, desteklenen bir lipid çift tabakasının fosfatidiletanolamin lipidine etiketlenmiş pH'a duyarlı floresan boya kullanarak, pH modülasyon testini kullanarak mikroakışkan bir modelde protein-fosfoinositid etkileşimlerini gösteriyoruz. Proteinin fosfolipide bağlanmasından sonra pH'daki modülasyonlar floresan söndürmeye neden olur.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Desteklenen Lipid Çift Katmanlarının (SLB'ler) Oluşturulması

  1. 100 μL PI(4,5)P2 içeren SUV'ları 0.65 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 6,4 μL 0,2 N hidroklorik asit ekleyerek çözeltinin pH'ını ~ 3< br /> not: Çözeltinin pH'ını bir mikro pH probu ile donatılmış bir pH metre ile onaylayın (malzeme tablosuna bakın).
  2. pH ayarlı SUV solüsyonundan 10 μL'yi girişten her kanala pipetleyin ve solüsyon çıkışa ulaşana kadar pipet boyunca basınç uygulayın. Ucu pipetten ayırın ve cihaza takılı bırakın.
  3. Her kanal için yukarıdaki adımı tekrarlayın ve ardından cihazı RT.
    'da 10 dakika inkübe edin not: Veziküllerin mikrokanallara enjeksiyonu, cihaz montajından hemen sonra yapılmalıdır.
  4. Sırasıyla 60 cm (giriş borusu) ve 8 cm (çıkış borusu) uzunluğunda giriş ve çıkış borusu setlerini kesin.
    not: Boruyu çapraz olarak kesmek ve keskin bir kenar oluşturmak, boruyu giriş ve çıkışlara yerleştirmeyi kolaylaştırır. Çıkış borusu bir yay şeklinde olmalıdır. Giriş borusunun uzunluğu mikroskop kurulumuna bağlı olarak değişebilir. Borunun iç çapı 0,05 cm'dir.
  5. Cımbız kullanarak çıkış hortumu setini cihaza bağlayın ve ardından cihazı bir mikroskop tablasına bantlayın.
  6. Giriş borusu setinin bir ucunu konik bir tüpte bulunan 25 mL çalışma tamponuna daldırın ve borunun sabitlendiğinden emin olmak için bantlayın.
  7. Çözeltiyi yerçekimi akışı yoluyla mikro kanallardan itmek için konik tüpü cihazdan daha yüksek bir yere (~ 20 cm) yerleştirin; Bunu başarmak için bir laboratuvar jakı kullanılabilir.
  8. Her giriş tüpü için, borunun serbest ucundan 1 mL çalışan tampon çekmek için bir şırınga kullanın. Pipet ucunu girişten çıkarın ve giriş borusunun serbest ucunu cihaza yerleştirin.
    not: Bu adım sırasında kanala bir hava kabarcığı girme olasılığını azaltmak için girişe bir damla çalışma tamponu koyun. Giriş borusu cihaza takıldıktan sonra, fazla tamponu çıkarmak için tüy bırakmayan bir mendil kullanın.
  9. Tüm giriş borusu parçalarını cihaza bağlamak için yukarıdaki adımı tekrarlayın.
    not: Kanallardan akan akan tampon, fazla veziküllerin uzaklaştırılmasına ve çift tabakanın deneysel koşullara dengelenmesine yardımcı olur.
  10. Mikroskop kontrol yazılımını açın (malzeme tablosuna bakın). Sol panelde, "Mikroskop" sekmesine tıklayın ve "10X" hedefini seçin.
  11. Araç çubuğundaki "Canlı" ve ardından "Alexa 568" görüntü simgelerine tıklayın. İnce ve rota ayar düğmelerini kullanarak mikro kanallara odaklanın.
  12. SLB'lerin ve kanalların kalitesini kontrol etmek için cihazı tarayın (Şekil 1). Ardından, araç çubuğundaki "FL Shutter Closed" görüntü simgesini tıklayın.
  13. "Edinme" sekmesine tıklayın ve "Temel ayarlar" altında "Maruz kalma süresi"ni seçin. Maruz kalma süresini "200 ms" olarak ayarlayın.
  14. Sol panelde, "Çok Boyutlu Edinim"e tıklayın ve filtreler menüsü altında kırmızı kanalı seçin ("Alexa 568" olarak işaretlenmiştir). Ardından, "hızlandırılmış çekim" menüsüne tıklayın, zaman aralığını 5 dakikaya, süreyi 30 dakikaya ayarlayın ve "Başlat"a tıklayın.
    not: Süreye (30 dakika) ve akış hızına (~1.0 μL/dak) bağlı olarak, SLB'yi bir kanal içinde dengelemek için 30 μL çalışma tamponu kullanılır, yani 8 kanalın tümü için 240 μL çalışma tamponu kullanılır.
  15. "Ölç" sekmesi altındaki "Daire" aracını seçin ve herhangi bir kanalda bir daire çizin. Daire seçiliyken sağ tıklayın ve "Özellikler" i seçin. "Profil" sekmesi altında, floresan yoğunluğunu zamanın bir fonksiyonu olarak görüntülemek için "tüm T"yi işaretleyin.
    1. Bir sonraki adıma geçmeden önce bu eğrinin dengeyi gösteren bir platoya ulaştığından emin olun.
  16. Akışı durdurmak için tampon çözeltisini cihazla eşit bir toprağa indirin.
  17. Zaman atlamalı dosyayı kaydedin.

2. PI(4,5)P2 içeren SLB'lerle PLC-δ1 PH alanı etkileşiminin test edilmesi

  1. Çalışan arabelleği seyreltici olarak kullanarak PH alanının seyreltmelerini hazırlayın.
    not: Cihaz içinde sekiz kanal olduğundan, boş kontroller için bunlardan en az ikisini kullanın. Her iki taraftaki uzak uçları seçin ve kalan kanalları protein seyreltmeleri için kullanın. Aşağıdaki PH alanı konsantrasyonları test edildi: 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 ve 2.50 μM. Her seyreltmenin yaklaşık 200 μL'si, 30 dakika içinde dengeye ulaşmak için yeterliydi.
  2. Her seferinde bir tane, her bir çıkış borusunu ayırın ve bir pipet kullanarak çıkış kanalına her bir protein seyreltmesinden 200 μL uygulayın. Herhangi bir baskı uygulamayın, işi yerçekiminin yapmasına izin verin. Ucu pipetten ayırın ve mikroakışkan cihaza bağlı bırakın.
  3. Her kanal için yukarıdaki adımı tekrarlayın ve bu işlem sırasında kanallara hava kabarcıklarının girmediğinden emin olun.
  4. Proteini mikro kanallardan akıtmaya başlamak için giriş borusunu mikroakışkan cihazın altındaki bir toprağa indirin. Borunun serbest ucunu bir atık kabına bantlayın. Protein dilüsyonlarını 30 dk.
    boyunca akıtın not: Bu, akışı tersine çevirecek ve proteinin kanallara girmesine izin verecektir. İhtiyaç duyulan protein dilüsyonlarının dengelenme süresi ve hacmi, etkileşimin afinitesine bağlı olacaktır.
  5. Yazılımın sol panelinde, "Time Lapse" sekmesi altında, tekrar görüntülemeye başlamak için "Başlat"a tıklayın.
  6. Deney tamamlandığında, zaman atlamalı dosyayı kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1: SLB'lerin ve mikro kanalların bütünlüğünün değerlendirilmesi. (A) Yüksek kaliteli SLB'leri ve mikro kanalları gösteren bir resim. (B) Eksik füzyon. (C) Kaynaşmış mikro kanallar. (D) Bir mikro kanal içinde sıkışmış toz parçacığı. (E) Mikro kanallar içinde sıkışmış hava kabarcıkları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolinAvanti Polar Lipidler850457CPOPC (Bakış Açısı)
L-α-fosfatidilinositol-4-fosfatAvanti Polar Lipidler840045XPI4P
L-α-fosfatidilinositol-4,5-bifosfatAvanti Polar Lipidler840046XPI(4,5)P2
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolaminAvanti Polar Lipidler850757Cpapa; oSRB-POPE sentezi için gereklidir
Lissamine Rhodamine B Sülfonil Klorür (karışık izomerler)ThermoFisher BilimselL-20oSRB-POPE sentezi için gereklidir
pH'a Duyarlı Floresan Lipid Probu (oSRB-POPE)HouseYokKurum İçi Sentez (Huang D. et al. 2013)
Axiovert 200M Epifloresan MikroskobuCarl Zeiss MikroskobuYokmikroskop
AxioCam MRm KameraCarl Zeiss MikroskobuYokkamera
X-Alıntı 120Excelitas TeknolojileriYokışık kaynağı
Alexa 568 Filtre SetiCarl Zeiss MikroskobuYokEx/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 YazılımıCarl Zeiss MikroskobuYokGörüntü İşleme Yazılımı
Ipuç -larıVWR (VWR)10034-132200 uL pipet ucu; Protein çözeltisini mikroakışkan kanala uygulamak için ince ve pürüzsüz uç
Ipuç -larıVWR (VWR)53509-07010 uL pipet ucu; Vezikül solüsyonunu mikroakışkan kanala uygulamak için ince ve pürüzsüz uç
Orion Star A321 pH metreTermo BilimselSTARA3210pH metre
Orion mikro pH probuTermo Bilimsel8220BNWPmikro pH probu
N-(2-Hidroksietil)-piperazin-N'-(2-Etansülfonik Asit)VWR (VWR)VWRB30487HEPES, Serbest Asit
Sodyum KlorürVWR (VWR)BDH8014-2.5KGRNaCl (Doğal)
BoruMüttefik Tel ve KabloTFT-200-24 Nİç Çap: 0.020-0.026 inç (0.051-0.066 cm); Duvar Kalınlığı: 0.010 inç (0.025 cm); Esnek Politetrafloroetilen İnce Duvarlı Boru; Doğal Renk
Azot Gazı - EndüstriyelPraxair MağazasıYokYerel Sağlayıcı
Oksijen Gazı - EndüstriyelPraxair MağazasıYokYerel Sağlayıcı
Sıvı AzotPraxair MağazasıYokYerel Sağlayıcı
Serisi

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fosfolipaz C Ba lanmasFloresan S n mlenme TespitiMikroak kan PlatformK k Tek Tabakal Vezik llerpH Duyarl Floresan BoyaFosfatidilinositol 45 bisfosfatPlekstrin Homoloji Alan

İlgili makaleler