1. Reaktif ve çözelti kurulumu
- Tam DMEM hazırlamak için, 440 mL DMEM'e 5 mL L-glutamin 200 mM, 5 mL penisilin-streptomisin 100x ve 50 mL fetal sığır serumu (FBS,% 10 hacim / hacim nihai konsantrasyon) ekleyin.
not: Bu çözelti 4 °C'de 1 ay saklanabilir.
- % 1.5 (a / h) bir çözelti elde etmek için 150 mg düşük jelleşmeli agarozu 85 ° C'de 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözerek agaroz çözeltisi hazırlayın. 0,22 μm filtre ile süzülerek sterilize edin. 1.5 N'de 1 mL agaroz çözeltisi hazırlayın
- Biyoreaktör ortamını hazırlayın.
- 13.4 g DMEM tozunu 1 L ultra saf H2O içinde çözün.
not: Uygulamaya bağlı olarak, gerekli nihai hacim farklı olabilir (ör., 500 mL ortam için, 6.7 g tozu 500 mL H2O'da çözün).
- % 2 FBS, 10 mM NaHCO3, 1x penisilin-streptomisin (100x) ve% 2 D2O ekleyin (ör., 500 mL ortam için, 10 mL FBS, 0.4 g NaHCO3, 5 mL penisilin-streptomisin 100x ve 10 mL D2O ekleyin).
- Bir pH metre kullanarak pH'ı ölçün ve gerekirse HCl.
ekleyerek 7,4'e ayarlayın
not: Tipik olarak, başlangıç pH'ı 7.4'e çok yakındır.
- Biyoreaktör ortamını vakumla çalışan steril bir filtre ile steril 250 mL veya 500 mL cam şişede filtreleyin.
- Laminer akış başlığında, şişeyi iki hortum nozullu steril bir çelik başlıkla kapatın ve bunları pompaya bağlanacak bir FEP borusuna (od = 1/8", iç = 1.6 mm) ve hava girişi için 0.22 μm PTFE şırınga filtresine bağlayın.
2. Biyoreaktör kurulumu
- Akış birimini, daha sonra hücreleri içeren tüp ile değiştirilecek olan ikinci bir akış birimi NMR tüpü kullanarak monte edin. Doğru montaj için akış ünitesi çalıştırma talimatlarına bakın.
not: Bu noktada, akış ünitesi zaten temizlenmiş olmalıdır (değilse, adım 4.2'yi gerçekleştirin).
- Akış ünitesi sıcaklık kontrolüne bağlı su banyosunu 37 °C'ye ayarlayın. Rezervuar şişesini su banyosuna yerleştirin.
- Rezervuar şişesinin FEP borusunu pompaya bağlayın.
- Biyoreaktör valfini "baypas" konumuna getirin ve pompayı bir ortamla önceden doldurun.
- Biyoreaktör valfini "akış" konumuna çevirin ve biyoreaktörü ortamla 0.1 mL/dk'da önceden doldurun.
3. Hücre örneğinin hazırlanması
- Hücreleri CO2 inkübatöründen toplayın.
- CO2 inkübatörden transfekte edilmiş HEK293T hücrelerden oluşan bir T75 şişesi alın ve harcanan ortamı çıkarın.
- Hücreleri oda sıcaklığında (~ 20 ° C) 7 mL (her biri) PBS ile iki kez yıkayın.
- Hücreleri ayırmak için 2 mL tripsin / EDTA kullanın. Çözeltiyi ekledikten sonra, hücreleri ayırmak için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
not: Kopyalanan hücrelerin ayrılması biraz daha uzun sürebilir. Gerekirse, hücreleri 37 ° C'de inkübe edin.
- Tripsini 20 mL tam DMEM ile inaktive edin; hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek ve 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktararak iyice yeniden süspanse edin.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Kalan ortamı çıkarmak için hücreleri oda sıcaklığında 10 mL PBS ile yıkayın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücre peletini 1.5 mL kapaklı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Hücreleri agaroz ipliklerine gömün.
- Bir su banyosunda 85 ° C'de katılaşmış agarozun bir alikotunu eritin ve ardından bir blok ısıtıcıda 37 ° C'de çözelti içinde tutun.
- Bir Pasteur pipeti ile akış ünitesi NMR tüpünün altını 60-70 μL %1.5 agaroz jel ile doldurun ve buzun içine yerleştirin. Bu, hücre numunesinin 5 H NMR bobininin aktif hacmi içine yerleştirilmesine izin veren ~ 1mm yüksekliğinde bir alt tapa oluşturacaktır.
- Adım 3.1.8'de elde edilen hücre peletini termoblokta 37 °C'de 15-20 saniye ısıtın.
- Hücreleri 450 μL agaroz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Kabarcık oluşumunu önlemek için dikkatli olun.
- Hücre-agaroz süspansiyonunu 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı ~ 30 cm uzunluğunda bir kromatografi PEEK tüpüne (iç çap = 0.75 mm) aspire edin.
not: Aspirasyondan önce, kabarcık oluşumunu önlemek için boru ve şırınganın ölü hacmi oda sıcaklığında PBS ile önceden doldurulmalıdır. Borunun uzunluğu kritik değildir.
- Hortumu oda sıcaklığında 2 dakika soğumaya bırakın.
- Akış birimi NMR tüpünü oda sıcaklığında 100 μL PBS ile önceden doldurun.
- Şırıngayı hafifçe iterek agaroz içine gömülü hücrelerin ipliklerini akış ünitesi NMR tüpüne dökün.
not: NMR tüpünü homojen bir şekilde doldurmak için, PEEK borusunun ucunu NMR tüpünün altına yerleştirerek başlayın ve yavaşça sola-sağa sallanarak yukarıya doğru ilerleyin.
- 3.2.5, 3.2.6 ve 3.2.8 adımlarını, tüm hücre-agaroz süspansiyonu dökülene kadar tekrarlayın.
- Hücreleri biyoreaktöre yerleştirin.
- Boş NMR tüpünü akış ünitesinden çıkarın ve giriş borusunda kalan gaz kabarcıklarını gidermek için akış hızını birkaç dakika 2 mL/dk'ya yükseltin.
- Akış hızını 0,2 mL/dk'ya ayarlayın ve hücreleri içeren NMR tüpünü yavaş ama istikrarlı bir şekilde yukarı doğru iterek yerleştirin.
not: Ortamın aktif akışı, aksi takdirde yerleştirme sırasında meydana gelecek olan tüp içeriğinin girişten geri akışını önler.
4. Biyoreaktör çalışması ve temizliği
- NMR deneyi sırasında biyoreaktör çalışması.
- NMR spektrometresindeki sıcaklığı 310 K'ye ayarlayın.
- Akış ünitesini spektrometreye yerleştirin.
- Hücre içi NMR deneylerinin tüm süresi boyunca biyoreaktör ortamını 0,1 mL/dk'lık bir akış hızında besleyin.
- Deney sırasında istenen zamanda, silikon boruyu steril uzun iğneli bir şırınga ile delerek dış molekülün konsantre bir çözeltisini orta rezervuar şişesine enjekte edin.
not: Molekülün ortamdaki nihai konsantrasyonu, hücre toksisitesi ile ilgili önceki bilgilere ve varsa hücre zarı boyunca tahmin edilen/tahmin edilen difüzyon hızına dayalı olarak seçilmelidir.
- NMR deneyinin sonunda, hücreleri içeren tüpü boş bir tüp ile değiştirin ve akış ünitesini su ile durulayın.
- Biyoreaktör yerinde temizlik.
- Aşağıdaki çözeltileri 1 mL / dk'da akıtarak akış ünitesini temizleyin: 0.2 M sodyum hidroksit (NaOH); 3 M sitrik asit; 0.2 M NaOH, her biri en az 30 dakika, ardından >2 saat boyunca steril filtrelenmiş ultra saf su.
- Her çalıştırmadan sonra rezervuar şişesini ve boru tertibatını temizleyin ve otoklavlayın.
5. NMR deneyleri
- NMR deneylerinin kurulumu.
not: Hücre toplama ve veri toplama arasında herhangi bir gecikmeyi önlemek için, hücre içi NMR örneğinin hazırlanmasından önce bu adımları önceden gerçekleştirin.
- NMR spektrometresinde yeni bir veri kümesi oluşturun ve istenen NMR deneyleri için parametreleri ayarlayın.
- 1D 1H NMR deneyleri için parametreleri ayarlayın.
- 1H taşıyıcı frekansını su sinyalinde 4.7 ppm'de ortalayın.
- zgesgp darbe programını seçin, spektral genişliği 20 ppm'ye ve su bastırma için 1.000 μs 180° kare darbeye ayarlayın. Taramalar arası gecikmeyi 1 sn olarak ayarlayın. 32 tarama ile spektrumu elde edin.
- Etiketlenmemiş CA II'yi ifade eden hücreler için: p3919gp darbe programını seçin, spektrumun imino bölgesini kapsayacak şekilde spektral genişliği 30 ppm'ye ayarlayın ve binom su bastırma gecikmesini ayarlayın, böylece maksimum uyarma ilgilenilen sinyallerin kimyasal kaymalarına odaklanır (d7 = 20 μs, ilgilenilen sinyallerin (d7 = 20 MHz'de 950 μs). Taramalar arası gecikmeyi ≥1 sn'lik olarak ayarlayın. 512 tarama ile edinin.
- 15N etiketli SOD1 eksprese eden hücreler için: sfhmqf3gpph darbe programını seçin, 1H ve 15N spektral genişliklerini sırasıyla 16 ve 50 ppm'ye, şekilli darbe ofsetini ve uyarma bant genişliğini sırasıyla 8.5 ve 6 ppm'ye ayarlayın ve ayırma şeması için 350 μs'lik bir darbe (alete bağlı olarak garp4 veya diğer). Taramalar arası gecikmeyi 0,3 sn olarak ayarlayın. 15N boyutunda 16 tarama ve 128 artış elde edin.
- Gerçek zamanlı NMR spektrum alımı.
- Biyoreaktör NMR spektrometresine yerleştirildikten sonra, ortamın değiştirilmesine izin vermek için birkaç dakika bekleyin.
not: PBS, %2 D2O içeren bir ortamla değiştirildiğinden, bu işlem kilit sinyalinin görünümünden kolayca izlenir.
- 1H kanalının eşleşmesini ve ayarını ayarlayın, mıknatısı şimleyin ve 1H 90° sert darbe uzunluğunu hesaplayın.
- Her darbe dizisindeki 1H güç seviyelerini 1H sert darbeye göre ayarlayın.
- Numune içeriğini ve alan homojenliğini kontrol etmek için ilk zgesgp 1H spektrumunu kaydedin.
- zgesgp ve p3919gp/sfhmqcf3gpph deneylerini istenen sayıya kopyalayın ve bunları alım biriktiricisinde sıraya koyun.
CA: zgesgp spektrumları yalnızca numunenin durumunu ve alan homojenliğini kontrol etmek için kullanılır; bu nedenle, atlanabilir veya daha az sıklıkta kaydedilebilirler.
- Etiketlenmemiş CA II'yi ifade eden hücreler için: sıfır doldurma ve üstel çizgi genişletme penceresi işlevi (LB = 20 Hz) uygulayarak p3919gp spektrumlarını işleyin.
- 15N etiketli SOD1 eksprese eden hücreler için: her iki boyutta da sıfır doldurma ve kare sinüs çan penceresi fonksiyonu (SSB = 2) uygulayarak sfhmqcf3gpph spektrumlarını işleyin.
not: İşlenmiş spektrumların boyutu, sinyalsiz bölgelerin çıkarılmasıyla daha da azaltılabilir (Topspin'de bu, istenen STSR ve STSI değerlerinin ayarlanmasıyla yapılır).
