$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
NOT: Aşağıdakiler, bir QCM biyosensörü kullanarak ilacı tanıyan T7 fajlarının taranması ve taranan fajların E. coli (BLT5615) enfeksiyonu yoluyla geri kazanılması için adımlardır. Kendi kendine birleşen bir tek tabaka (SAM) oluşturan küçük bir molekülün bir türevinin sentezi ve T7 faj ile görüntülenen 15-mer rastgele peptit kütüphanesinin inşası için protokoller başka bir yerde bulunabilir.
1. QCM sensör çipinin hazırlanması
- 27 MHz'lik bir QCM aparatının osilatörüne seramik bir sensör çipi takın ve küçük molekül immobilizasyonundan önce hava fazındaki içsel frekansı (Hz) kaydedin.
- Çipi ayırın ve SAM oluşturan küçük bir molekül türevinin 20 μL'lik bir çözeltisini (%70 etanol içinde 1 mM) bir pipet kullanarak sensör çipinin altın elektrodu üzerine bırakın.
Dikkat: Altın elektrotun (Au, 0,1 mm kalınlık, 2,5 mm iç çap, 4,9 mm2) bulunduğu sensör çip kristali son derece incedir ve kolayca çatlayabilir (SiO2, 0,06 mm kalınlık, 9 mm iç çap). Bu nedenle, dikkatli bir şekilde pipetleyin.
- Oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) ıslak dokulu ve oda ışıklarından korunmuş bir Petri kabında 1 saat bekletin.
- Elektrot yüzeyini ultra saf suyla nazikçe yıkayın; Ardından, bir şırınga veya hava silgi ile hava üfleyerek su damlalarını çıkarın.
- QCM aparatı için sensör çipini kurun ve hareketsiz hale getirilen küçük molekülün miktarını ölçmek için hava fazındaki frekanstaki azalmayı kaydedin.
not: Başarılı küçük molekül immobilizasyonu için en az 100 Hz içsel frekans gereklidir (1 Hz, 30 pg'yi hareketsiz hale getirir).
2. Bir QCM biyosensörü kullanarak T7 faj kütüphanesinin biyopanlanması (Şekil 1)
- QCM biyosensörüne özel bir manyetik karıştırıcı ile bir küvet yerleştirin ve 8 mL reaksiyon tamponunu (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) küvete dökün.
- QCM sensör çipini osilatöre takın ve çipi 1000 rpm'de karıştırılan tampona daldırmak için osilatörün kolunu aşağı çekin.
- Kişisel bilgisayarda (PC) QCM frekansını izlemeye başlayın ve sensorgram, frekans kaymasının yaklaşık 3 Hz/dk'sına dengelenene kadar bekleyin.
- Küvete 8 μL T7 faj kütüphanesi (1-2 × 1010 pfu/mL) enjekte edin (son konsantrasyon: 1-2 × 107 pfu/mL) ve sensör üzerindeki enjeksiyon noktasını işaretleyin.
- T7 fajlarının altın elektrot yüzeyinde hareketsiz hale getirilen küçük moleküle bağlanmasından kaynaklanan frekans düşüşünü 10 dakika boyunca izleyin.
- QCM frekans monitörünü durdurun, sensör çipini osilatörden çıkarın ve hava üfleyerek ve/veya mendillerle emerek tamponu çıkarın.
- Sensör çipini nemli bir Petri kabına koyun ve E. coli (BLT5615) süspansiyonunun 20 μL'sini bırakın (OD600 = 0.5-1.0, 37 ° C'de 1 mM'ye IPTG ekleyerek çalkaladıktan sonra) log fazındaki konakçı hücreler altın elektrot üzerine.
- Yemeğin kapağını kapatın ve ışığı engellemek için alüminyum folyo ile örtün.
- Bağlı T7 fajlarının geri kazanımını artırmak için çanağı 37 ° C'de 30 dakika boyunca 96 oyuklu bir mikroplaka karıştırıcısında (1000-1500 rpm) inkübe edin.
- Çözeltinin 20 μL'sini geri kazanın ve 200 μL LB ortamına süspanse edin.
not: Bu adımda elde edilen numuneler 4 °C'de bir hafta süreyle muhafaza edilebilir.
- Üreticinin talimatlarında açıklanan genel prosedüre göre plak izolasyonu ve DNA dizilimi için faj çözeltisinin bir seyreltme serisini hazırlayın.
