$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Sistemin hazırlanması
- MALS ve dRI dedektörlerini FPLC'nin UV dedektörünün akış aşağısına bağlayın. UV ve MALS dedektörleri arasına önemli miktarda dedektörler arası hacim ekleyeceği için pH ve iletkenlik dedektörlerini atlayın. Kolondan dedektörlere ve dedektörler arasında 0.25 mm iç çap kılcal boru ve dedektörlerin çıkışında atık veya fraksiyon toplayıcıya 0.75 mm iç çap kılcal boru kullanın.
- FPLC'nin G/Ç Kutusu aracılığıyla UV dedektöründen MALS analog girişine analog çıkış ve FPLC'den MALS Autoinject'e dijital çıkış dahil olmak üzere FPLC ile dedektörler arasında gerekli sinyal bağlantılarının kurulduğundan emin olun.
- En az 20 kDa ila 500 kDa'lık bir fraksiyonlama aralığını kapsayan uygun bir analitik SEC sütunu kurun. Kolonun MW, pH ve numune ve mobil fazın diğer özellikleri için uygun olup olmadığını belirlemek için ürün bilgilerini kontrol edin.
2. Tamponun hazırlanması, sistemin gece boyunca yıkanması ve temizliğin kontrol edilmesi
- HPLC dereceli reaktifler kullanarak, 50-100 mM NaCl ile 1 L fosfat tamponlu salin hazırlayın. Şişe üstü polieter sülfon filtresi veya benzerini kullanarak tamponu 0,1 μm'ye kadar filtreleyin. İlk 50-100 mL tamponu bir atık şişeye filtreleyin ve kuru filtrelerdeki partikülleri gidermek için atın ve ardından kalanını filtrelenmiş, deiyonize su ile iyice yıkanmış ve tozun girmesini önlemek için kapatılmış temiz, steril bir şişeye filtreleyin.
not: Tris tamponu gibi diğer mobil faz çözücüleri, bu çözücülerde tercihen çözünen ek proteinlerin analiz edilmesi gerekiyorsa kullanılabilir.
- Tampondaki sütunu dengelemek ve partikülleri gidermek için gece boyunca 0,5 mL/dk'lık bir akış hızında veya sütun üreticisi tarafından başka bir şekilde tavsiye edildiği şekilde yıkayın. FPLC'nin Sürekli akış modunu kullanın ve tüm SEC-MALS çalıştırmaları tamamlanana kadar akışın durmadığından emin olun.
- Gece yıkama sırasında dRI akış hücresini Temizleme moduna alın. Örnek çalıştırmalarına başlamadan önce tahliyeyi kapatın.
- Yıkamaya başlarken, kolondaki ani bir basınç değişikliğinin neden olduğu "kolon dökülmesi" etkisini (veya partiküllerin salınmasını) önlemek için akış hızını kademeli olarak artırın.
- Sistemin oldukça kararlı ve parçacıksız olduğu ve istenen mobil faz ile dengede olduğu biliniyorsa, gece yıkamasını daha kısa, 2-3 saatlik bir yıkamayla değiştirin.
- Biriken parçacıkları serbest bırakmak için kolonun akış aşağısındaki boruya hafifçe vurarak ve MALS cihazının ön panel ekranındaki 90° dedektördeki sinyali gözlemleyerek sistem temizliğini kontrol edin. Tepeden tepeye gürültünün 50 -100 μV'den fazla olmadığını doğrulayın.
- Enjektörün parçacıklardan arınmış olduğunu doğrulamak için 'boş' bir enjeksiyon yapın. 'Boş', taze, steril bir şişede hazırlanan çalışan tampondur.
- Partikül tepe noktası hacim olarak 1 mL'den fazla değilse ve taban çizgisinin üzerinde 5 mV'den fazla değilse, sistem numuneler için hazırdır. Aksi takdirde, temizleyene kadar ek boş enjeksiyonlar yapın veya enjektörü temizlemek için bakım yapın.
3. Numunenin hazırlanması ve yüklenmesi
- SEC tamponunda 1-2 mg / mL'de en az 200 μL BSA hazırlayın.
not: Yağışı önlemek için, BSA asla saf suda çözülmemelidir.
- Bir şırınga ucu filtresi kullanarak proteini 0.02 μm'ye kadar filtreleyin.
- Kuru filtrelerdeki partikülleri ortadan kaldırmak için ilk birkaç damla süzüntüyü atın.
- Alternatif olarak, çözünmeyen agregaların ve diğer büyük partiküllerin çökelmesini sağlamak için numuneyi 15 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
- Döngüye 100 μL BSA çözeltisi enjekte edin.
not: Bu, önerilen malzeme miktarıdır ve numunenin stabilite veya kullanılabilirlik gibi koşullarına bağlı olarak az ya da çok enjekte edilebilir. Enjeksiyon başına gereken protein miktarı, moleküler ağırlık ile ters orantılı olarak değişir, moleküler ağırlık 33 kDa veya BSA'nın yarısı ise, iki kat daha fazla protein kütlesine ihtiyaç duyulur.
4. MALS yazılımının hazırlanması
- Yeni Aç | MALS yazılım menüsündeki Yöntem'den deneme yapın ve Işık Saçılımı sistem yöntemleri klasöründen Çevrimiçi yöntemi seçin. Bir DLS dedektörü varsa, Işık Saçılımı | QELS klasörü ile.
- Konfigürasyon bölümünde, numune ve mobil fazın parametrelerini ayarlayın.
- Genel Pompa görünümünde, akış hızını FPLC'de kullanılan hıza ayarlayın.
- Genel Pompa görünümü, Solvent dalı, Ad alanında PBS'yi seçin.
- Enjektör görünümünde, Örnek dalı, Adı BSA olarak girin ve dn/dc = 0.185 (değiştirilmemiş proteinler için standart değer), A2 = 0 ve UV sönme katsayısı = 0.667 mL/(mg-cm).
not: Diğer proteinler için, UV280 nm sönme katsayısı literatürde bulunabilir veya çeşitli kamu malı yazılım araçları kullanılarak dizisinden hesaplanabilir.
- Prosedürler bölümünde, Temel Koleksiyon görünümünde, Otomatik Enjeksiyonda Tetikleyici onay kutusunu seçin ve SEC sütununun toplam geçirgenlik hacmine ulaşılana kadar tüm elüsyon için verilerin toplanması için çalıştırma süresini 70 dakika olarak ayarlayın.
not: Gerekli süre kolona ve akış hızına göre değişebilir - 0,5 mL / dk'da standart 7,8 mm x 300 mm HPLC-SEC kolonu için 35 dk toplama gereklidir.
- Çalıştır düğmesine tıklayarak MALS yazılımında deneyi başlatın. MALS dedektörü aracılığıyla FPLC cihazından nabız sinyalini aldıktan sonra verileri okumaya başlayacaktır.
- Cihazın ön panelindeki Otomatik Sıfırlama düğmesine tıklayarak dRI sinyalini sıfırlayın.
5. FPLC yazılımının hazırlanması
- Proteinin adını ve çalıştırmayı FPLC yazılımına Kılavuzda | Manuel talimatları yürütün | İşareti ayarlayın.
- Enjeksiyon valfini Manuel yükten Akış yolu altında Enjeksiyona geçirin | Enjeksiyon valfi.
- G/Ç kutusunun altına 0,5 s'lik bir darbe yerleştirerek bir darbe sinyali ekleyin | Darbe dijital çıkışı. Bu, MALS yazılımında veri toplamayı tetikleyecektir.
>6. Örneği döngüye enjekte edin. Deneme çalıştırmasını başlatmak için FPLC yazılımında Yürüt'e tıklayın.