Method Article

Etkileşen İki Proteini İzole Etmek için Bimoleküler Tamamlama Afinite Saflaştırması

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Hastings, J. F. et al. Bimoleküler Tamamlama Afinite Saflaştırması (BiCAP) ile Çok Proteinli Sinyal Komplekslerinin Diseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, konformasyona özgü tek alanlı antikorlar kullanarak spesifik protein dimerlerini tespit etmek ve izole etmek için bimoleküler tamamlama afinite saflaştırmasını, BiCAP'i gösterdik.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon

NOT: BiFC vektörlerinin transfeksiyonu için yüksek verimli ve nispeten homojen bir transfeksiyon elde etmek önemlidir. Vektörler muhtemelen herhangi bir standart transfeksiyon reaktifi ile uyumlu olacaktır ve transfeksiyon koşulları buna göre optimize edilmelidir. Kütle spektrometresi yapmak için, genellikle 10 cm'lik tabaklar içindeki hücreleri kültürlüyoruz, ancak bu, daha az malzeme gerektiren deneyler için orantılı olarak daha küçük tabaklara veya plakalara indirgenebilir.

  1. 1.0 ×10 mL DMEM ortamı içeren 10 cm'lik bir tabakta 6 HEK293T hücreli,% 10 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM (Ömer ÇiçeğGibco (Gibco)11995-073Hücre kültürü
FBS (FBS)Yaşam Teknolojileri Avustralya10099-141Hücre kültürü
Penisilin / StreptomisinYaşam Teknolojileri Avustralya15070-063Hücre kültürü
jetPRIME transfeksiyon tamponuÇoklu artı114-15Hücre kültürü
jetPRIME transfeksiyon reaktifiÇoklu artı114-15Hücre kültürü
PhosSTOP (Fosfataz inhibitörü)Sigma-Aldrich4906837001Hücre kültürü
Komple, Mini, EDTA içermeyen Proteaz inhibitör kokteyliRoche11873580001Plastik eşya
Hücre KazıyıcıSarstedt83,1832
GFP-Trap_AChromotek GmbHGTA-100Agaroz boncuklara bağlı GFP nano gövdesi
N-terminal GFP monoklonal antikoruCesaretMMS-118PBiFC vektörleri içindeki V1 etiketini algılar
C-terminal GFP monoklonal antikoruRoche11814460001BiFC vektörleri içindeki V2 etiketini algılar
Örnek tamponCanlandırıcıNP00081 mL β-merkaptoetanol ile desteklenmiştir.
Sıralama dereceli modifiye tripsinPromega ŞirketiV5117hHücre kültürü
LoBind mikrosantrifüj tüpleriBakım Noktası Teşhisi0030 108 116Plastik eşya
İyodoasetamidSigma-AldrichI1149-5GUltra saf suda 5 mg / mL'de hazırlanır
LTQ Orbitrap Velos ProTermo Balıkçı
DH5α hücreleriTermo BalıkçıIsı şokuna yetkin hücreler
Gazetesi Belediyesi Serisi Serisi Gazetesi

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bimolecular ComplementationAffinity PurificationProtein Interaction DetectionFluorescence MicroscopyAgarose BeadsWestern BlottingSDS PAGECell LysisTransfection ReagentHEK293T Cells

Related Articles