Etkileşen İki Proteini İzole Etmek için Bimoleküler Tamamlama Afinite Saflaştırması

Özet

Kaynak: Hastings, J. F. et al. Bimoleküler Tamamlama Afinite Saflaştırması (BiCAP) ile Çok Proteinli Sinyal Komplekslerinin Diseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, konformasyona özgü tek alanlı antikorlar kullanarak spesifik protein dimerlerini tespit etmek ve izole etmek için bimoleküler tamamlama afinite saflaştırmasını, BiCAP'i gösterdik.

Protokol

1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon

NOT: BiFC vektörlerinin transfeksiyonu için yüksek verimli ve nispeten homojen bir transfeksiyon elde etmek önemlidir. Vektörler muhtemelen herhangi bir standart transfeksiyon reaktifi ile uyumlu olacaktır ve transfeksiyon koşulları buna göre optimize edilmelidir. Kütle spektrometresi yapmak için, genellikle 10 cm'lik tabaklar içindeki hücreleri kültürlüyoruz, ancak bu, daha az malzeme gerektiren deneyler için orantılı olarak daha küçük tabaklara veya plakalara indirgenebilir.

1. 1.0 ×¹⁰ mL DMEM ortamı içeren 10 cm'lik bir tabakta 6 HEK293T hücreli,% 10 FBS ve% 10 Penisilin / Streptomisin (1:100) ile desteklenmiş tohum.
2. Her BiFC vektörünün 2.5 μg'ını 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 500 μL transfeksiyon tamponuna seyreltin (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. 10 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
4. 10 saniye boyunca vorteks karışımı, ardından kısaca santrifüjleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
5. DNA transfeksiyon karışımını damla damla plakaya ekleyin. BiFC füzyon proteinlerinin etkileşime girmesi ve Venüs'ün katlanması ve florofor olgunlaşması için hücreleri yeterli bir süre boyunca inkübe edin, genellikle ~ 8 - 24 h.
   NOT: Venüs için en yüksek uyarılma 515 nm'dir ve en yüksek emisyonu 528 nm'dir, ancak bu, GFP floresansını görselleştirmek için ayarlanmış standart bir floresan mikroskobu kullanılarak kolayca görülebilir.

2. Numune Hazırlama

1. Lizatların hasadı
   1. Lizat toplamadan önce, Hücre Lizis Tamponu [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 1 (h / h) iyonik olmayan deterjan hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız)]. 4 °C'de saklayın.
   2. Hasattan hemen önce, proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörü ile 10 mL Hücre Lizis Tamponu takviyesi yapın (Malzeme Tablosuna bakınız). Takviye edilmiş Hücre Lizis Tamponunu buz üzerinde tutun.
   3. Hücreleri buz gibi soğuk PBS'de iki kez yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 1 mL buz gibi soğuk takviyeli Hücre Lizis Tamponu ekleyin. Tamponun tüm yüzey alanına yayıldığından emin olarak çanağı buzun üzerine yerleştirin.
   4. Buz üzerinde yaklaşık 5 dakika inkübe edin, daha sonra hücreleri kazımak ve önceden soğutulmuş 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir hücre kazıyıcı (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
   5. Toplanan lizatı 18.000 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyerek hücresel kalıntıları çıkarın ve temizlenmiş süpernatantı taze mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
      not: Bu noktada, lizat hemen kullanılabilir veya -80 ° C'de saklanabilir. Ayrıca, transfeksiyon ve afinite saflaştırmasının etkinliğinin doğrulanabilmesi için bir miktar ham lizat tutulması tavsiye edilir.
2. Afinite saflaştırma
   not: BiCAP izolasyon adımı, agaroz boncuklara konjuge edilmiş GFP nano gövdesi kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Agaroz boncuklarını 1 mL PBS'de uygun bir hacimde (numune başına 20 μL + 10 μL fazla) yıkayarak hazırlayın. Boncukları 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
   2. Her lizat örneğine 20 μL ekleyin.
   3. Numuneleri uçtan uca döndürme ile 4 ° C'de 2 saat inkübe edin.
      not: Bu noktada, numuneler SDS-PAGE ve western blotlama veya kütle spektrometresi ile analiz için hazırlanabilir.
3. Batı lekeleme için BiCAP eluent'in hazırlanması.
   1. Boncukları 300 x g'da santrifüjleyin ve Hücre Lizis Tamponunda üç kez yıkayın.
   2. Yıkanmış boncukları 50 μL'lik uygun şekilde seyreltilmiş numune tamponunda yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve numuneleri 95 °C'de 2-3 dk.
      ısıtın not: Bu şekilde hazırlanan numuneler -20 °C'de birkaç ay saklanabilir.
   3. Hem V1 etiketi hem de V2 etiketleri (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ayrıca ilgilenilen diğer proteinler için SDS-PAGE ve western blotting gerçekleştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM (Ömer Çiçeğ	Gibco (Gibco)	11995-073	Hücre kültürü
FBS (FBS)	Yaşam Teknolojileri Avustralya	10099-141	Hücre kültürü
Penisilin / Streptomisin	Yaşam Teknolojileri Avustralya	15070-063	Hücre kültürü
jetPRIME transfeksiyon tamponu	Çoklu artı	114-15	Hücre kültürü
jetPRIME transfeksiyon reaktifi	Çoklu artı	114-15	Hücre kültürü
PhosSTOP (Fosfataz inhibitörü)	Sigma-Aldrich	4906837001	Hücre kültürü
Komple, Mini, EDTA içermeyen Proteaz inhibitör kokteyli	Roche	11873580001	Plastik eşya
Hücre Kazıyıcı	Sarstedt	83,1832
GFP-Trap_A	Chromotek GmbH	GTA-100	Agaroz boncuklara bağlı GFP nano gövdesi
N-terminal GFP monoklonal antikoru	Cesaret	MMS-118P	BiFC vektörleri içindeki V1 etiketini algılar
C-terminal GFP monoklonal antikoru	Roche	11814460001	BiFC vektörleri içindeki V2 etiketini algılar
Örnek tampon	Canlandırıcı	NP0008	1 mL β-merkaptoetanol ile desteklenmiştir.
Sıralama dereceli modifiye tripsin	Promega Şirketi	V5117h	Hücre kültürü
LoBind mikrosantrifüj tüpleri	Bakım Noktası Teşhisi	0030 108 116	Plastik eşya
İyodoasetamid	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Ultra saf suda 5 mg / mL'de hazırlanır
LTQ Orbitrap Velos Pro	Termo Balıkçı
DH5α hücreleri	Termo Balıkçı		Isı şokuna yetkin hücreler

Gazetesi Belediyesi Serisi Serisi Gazetesi