1. Numune Hazırlama
- İstenilen biyomolekülü saflaştırın.
not: Bu protokol, üç kez 2 M NaCl ile değiştirildikten sonra satın alınan kokain bağlayıcı DNA aptamer MN4'ü kullanır ve ardından 3 kDa moleküler ağırlıklı kesme membranına sahip bir santrifüj filtre kullanılarak üç tur deiyonize su kullanılır.
- Sentezleyin ve saflaştırın veya istenen termolabil ligandı satın alın.
not: MN4 termolabil ligand kokaini bağlar. MN4 ayrıca, bu deneysel sıcaklıklarda ligand termolalitesi için negatif bir kontrol olarak kullanılan kinini de bağlar.
- Saflaştırılmış biyomolekülün diyalizi ve ligandların çözünmesi için tamponlar hazırlayın (20 mM sodyum fosfat ve 140 mM NaCl tamponu, pH 7.4, MN4 ve burada kullanılan ligandlar için).
- 0.5 - 1.0 kDa kesme ile diyaliz tüpü kullanarak biyomolekülü en az 2 L tampona karşı diyalize edin.
- Son tamponu (çalışma tamponu olarak adlandırılır), tampon ile tamamen dengelenmiş 0,2 μm'lik bir filtreden süzün.
- İstenilen ligand kütlelerini tartın ve bunları filtrelenmiş bir çalışma tamponunda çözün. İstenen ligand konsantrasyonları, doğru bir şekilde tartılamayacak kadar küçük kütleler gerektiriyorsa, konsantre bir ligand stoğu çözeltisi yapın (örneğin 10x).
not: Tüm DSC deneylerinin numune ve ligand için aynı çalışma tamponunu kullanması çok önemlidir, yani ligandın biyomolekülden farklı bir çalışma tamponu partisinde çözüldüğü bir deneyi asla gerçekleştirmeyin çünkü bu, verilerde tampon uyumsuzluğu artefaktlarına neden olacaktır.
- Biyomolekül stok çözeltisini, çalışma tamponu ile tamamen dengelenmiş 0,2 μm'lik bir filtreden süzün.
- Absorbans ölçümleri ile biyomolekül konsantrasyonunu belirleyin (MN4 gibi nükleik asitler için 260 nm ve proteinler için 280 nm).
- Hazırlanan biyomolekül ve ligandı 4 °C'lik bir buzdolabında (MN4 ve burada kullanılan ligandlar için uygundur) veya biyomolekül ve ligandlar donmayı tolere ediyorsa ve uzun süreli depolama gerekiyorsa -20 veya -80 °C'de saklayın. DSC'ye yüklemeden önce tampon, biyomolekül ve ligand çözeltilerinin gazını bir masa üstü gaz gidericide (Malzeme Tablosuna bakınız) boşaltın.
not: Gaz giderme, daha yüksek sıcaklıklarda DSC'de kabarcık oluşumunu önlemeye yardımcı olur. Kabarcıklar, DSC tepe şekillerini ve taban çizgilerini gizleyen sinyal artefaktlarına neden olur.
2. DSC Hazırlığı
- Basınç kolunu DSC'den sökün (Malzeme Tablosuna bakın).
- Silikon boruyu çalışma tamponundan çalıştırın ve referans kılcal damarın ön flanşına (metal açıklık) takın.
- Arka referans flanşını ön numune flanşına bağlayarak referans ve numune kılcal damarları arasında bir köprü oluşturun.
- Arka s'a bir parça silikon boru takın.ampbir vakum hattı takılı bir atık şişesine giden flanş
.
- DSC'yi 200 mL çalışma tamponu ile yıkamak için vakum hattını açın.
- DSC'nin referans kılcal damarını çalışma tamponu ile yükleyin. Referans kılcal flanşlara yaklaşık 3 - 5 cm'lik silikon boru bölümleri takın.
- Arka flanşın silikon borusuna 1 mL'lik bir pipet ucu yerleştirin. Bir pipetle 0.8 mL çalışma tamponu çizin ve tamponlu pipet ucunu ön referans flanşının silikon borusuna yerleştirin.
- Çalışma tamponunu ön silikon borudan referans kılcal damara ve arka flanşın takılı pipet ucuna geçirmek için pipet pistonunu yavaşça aşağı doğru bastırın. Çalışma tamponu seviyesi ön silikon borunun hemen üzerine ulaşana kadar pipet pistonunu aşağı doğru bastırın, ardından çalışma tamponu seviyesi arka silikon borunun hemen üzerine ulaşana kadar pipet pistonunu serbest bırakın.
- Referans kılcal damardaki hacmi kabarcıklardan arındırmak için çalışma arabelleğini ileri geri geçirmeyi tekrarlayın.
not: Genellikle, herhangi bir kabarcıkları temizlemek için çözeltinin ileri geri 10 geçişi yeterlidir.
- Arka pipet ucunu başparmağınızla kapatın ve silikon boru takılıyken referans flanşlarından çıkarmak için arka pipet ucunu ve ön pipeti yavaşça yukarı çekin.
- Numune kılcalını adım 2.6 - 2.9'da olduğu gibi çalışma tamponu ile yükleyin. Arka referans ve numune flanşlarına siyah plastik bir kapak yerleştirin ve ön flanşları açıkta bırakın.
- Basınç kolunu takın.
- DSC yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve güç okuması stabilize olduktan sonra arayüzün üst kısmındaki kırmızı yukarı oka tıklayarak cihaza basınç uygulayın; DSC gücü, cihaz sıcaklığı ve basınç okuması ile birlikte arayüzün sağ üst köşesindeki bir kutuda gösterilir.
not: DSC basınç uygularken güç okumasını izleyin. ~ 10 μW'den fazla güçteki değişiklikler, kılcal damarlarda kabarcık oluşumunu gösterir ve bu da verilerde artefaktlara neden olabilir. Devam etmeden önce çözeltiler çıkarılmalı ve daha fazla gazdan arındırılmalıdır.
- İleri ve geri tarama yaparak DSC'yi çalışma arabelleği ile dengeleyin. Ekranın sol tarafındaki "Deneysel Yöntem" sekmesinde, DSC'yi sıcaklık tarama modunda çalıştırmak için "Tarama" seçeneğinin seçili olduğundan emin olun.
not: Deneysel parametreler, sıcaklık tarama aralığı, tarama hızı, düşük ve yüksek sıcaklık dengeleme süresi ve tarama sayısıdır.
- "Deneysel Yöntem" sekmesi altındaki "Sıcaklık Parametreleri" ekinde, "Isıtma" düğmesine tıklayın. Alt ve üst deney sıcaklıkları için 1 ve 100 °C, tarama hızı için 1 °C/dak ve dengeleme periyodu için 60 s girin.
- Dengeleme periyodu için giriş alanının altındaki "Seri Ekle" düğmesine tıklayın. Açılır penceredeki "Eklenecek adımlar" alanına 2 girin (bir ısıtma ve bir soğutma taraması için) ve "Alternatif Isıtma/Soğutma" kutusunu işaretleyin. "Tamam" ı tıklayın; Eklenen taramalar arayüzün alt kısmında görünür. Her tarama için parametrelerin istendiği gibi olup olmadığını kontrol edin.
- Arayüzün üst kısmındaki yeşil "oynat" düğmesine tıklayarak denemeyi başlatın. İstediğiniz klasöre gidin ve açılır pencerede denemeyi kaydetmek için bir dosya adı girin. "Deneme Yöntemi" sekmesinin sağındaki "Veri" sekmesini tıklayarak deneme ilerlemesini görüntüleyin.
3. Termolabil Ligand DSC Veri Kümelerini Toplama
NOT: Minimum prosedür beş deneyden oluşur: ligandlı ve ligandsız tampon referans deneyleri (temel çıkarma için kullanılır), serbest biyomolekül ile numune deneyleri, ligand'a bağlı biyomolekül ve daha uzun bir yüksek sıcaklık dengeleme periyoduna sahip ligand'a bağlı biyomolekül.
- Örnek verilerin temel çıkarılması için referans denemeleri çalıştırın. DSC'yi her iki kılcal damardaki çalışma tamponu ile yeniden yükleyin ve 120 s'lik bir üst (yüksek sıcaklık) dengeleme süresi ile 1 °C dk-1'de uygun bir sıcaklık aralığında çok sayıda ileri ve geri tarama toplayın.
- Önceki arabellek dengeleme taramalarını arayüzün alt kısmından, her birini ayrı ayrı vurgulayarak ve arayüzün sağ ortasındaki kırmızı X işaretine tıklayarak silin. "Seri Ekle" düğmesine tıklayarak, "Eklenecek adımlar" alanına 20 girerek ve "Alternatif Isıtma/Soğutma" kutusunu işaretleyerek yeni taramaları ekleyin. Tamam'a tıklayın ve yukarıdaki gibi yeşil oynat düğmesine tıklayarak denemeyi çalıştırın.
- Ligand için referans deneyleri elde etmek için her iki kılcal damarda istenen ligand konsantrasyonunu içeren çalışma tamponu ile 3.1 - 3.1.1 adımlarını tekrarlayın (sırasıyla 120 s ve 600 s yüksek sıcaklık dengeleme süreleri kullanarak iki ayrı deney toplayın, termolabil ligand dönüşümü için hız sabitinin elde edilmesinde kullanılır).
not: Burada kullanılan tarama hızı, sonraki deneylerde biyomolekülün ileri ve geri taramalarda termal dengede olmasını sağlar. 0,1 - 0,2 °C min-1 < tarama hızları gürültülü termogramlara yol açar ve DSC deneylerinde uygulanamaz. Sıcaklıklar, serbest biyomolekülün erime sıcaklığının çok altından, ligandla doymuş biyomolekülün erime sıcaklığının çok üzerine kadar uzanmalıdır (MN4 için ~ 20 - 80 ° C). Taramaların tekrarlanabilirliğini doğrulayın (örneğin, toplam 20 tarama için 10 ileri ve 10 geri tarama yeterlidir).
- Birden fazla ligand (kokain ve kinin gibi) kullanılıyorsa, ligandları kılcal damarlardan çıkarmak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için DSC'yi çalıştırmalar arasında 200 mL çalışma tamponu ile yıkayın (adım 2.5'ten itibaren tekrarlayın).
not: Önceki ligandın kılcal duvarlara güçlü bir şekilde adsorbe olup olmadığını ve tampon yıkama ile yeterince uzaklaştırılıp çıkarılmadığını kontrol etmek için ligand'a bağlı bir çalışmadan sonra serbest biyomolekül üzerinde bir çoğaltma deneyi yapmak yararlıdır. Serbest biyomolekül için termogramlar, ligand'a bağlı deneyden sonra daha büyük bir büyüklüğe ve daha yüksek denatürasyon sıcaklığına kaydırılmış gibi görünüyorsa, önceki ligandın yıkamadan sonra kalorimetrede hala mevcut olması muhtemeldir. Kılcal damarları %20 Contrad-70 ile 60 ° C'de 1 saat boyunca plastik kapaklar ve basınç kolu kapalıyken inkübe ederek adsorbe edilen ligandı çıkarın. DSC yazılımında, Deneysel Yöntem sekmesi altında deneysel modu "İzotermal" olarak değiştirin. Süre için 3.600 s ve izotermal sıcaklık için 60 °C'yi seçin, dengeleme süresi için sıfır girilir. "Deneysel Yönteme Ekle" yi tıklayın. İzotermal deney ekranın alt kısmında görünür. Tamamlandıktan sonra, cihazı 2 L deiyonize su ile yıkayın ve adım 2.5'ten itibaren tekrarlayın.
- Referans taramalarıyla aynı DSC yükleme prosedürünü ve deneysel parametreleri kullanarak örnek deneyleri çalıştırın. Serbest biyomolekül veri seti için, referans kılcalın çalışma tamponunu içerdiğinden, numune kılcalının ise çalışma tamponunda istenen konsantrasyonda serbest biyomolekülü içerdiğinden emin olun.
- Ligand'a bağlı deneyler için, ligandın referans kılcal damardaki çalışma tamponunda olduğundan ve biyomolekül artı ligandın numune kılcalındaki çalışma tamponunda olduğundan emin olun. Sistemi, adım 2.5'teki gibi farklı ligandların ilaveleri arasında yıkayın.
- Yüksek sıcaklık dengeleme periyodunun 600 s'ye çıkarıldığı ve diğer tüm deneysel parametrelerin adım 3.2.1.
'deki ile aynı olduğu termolabil liganda bağlı biyomolekül ile ek bir deney gerçekleştirin.
not: İkinci ligand-bağlı deney için yüksek sıcaklık dengeleme periyodunun süresi, ligandın kısa dengeleme süresi deneyinden daha hızlı tükenmesini sağlamak için basitçe seçilir. İlk deneyden gelen ligand'a bağlı pikler, tarama sayısının bir fonksiyonu olarak yavaşça bozulursa (örneğin, ardışık tepe maksimumlarındaki farklar ≤ 0,5 °C'dir), ikinci deney sırasında ligandı yeterince tüketmek için yüksek sıcaklık dengeleme periyodunda 10 ila 20 kat artış tahmin edin. Ligand dönüşümü için hız sabitinin doğru hesaplanması, ikinci deneyin ligandın birinciye göre daha hızlı tükenmesini gerektirir. İki deneyin küresel analizinden elde edilen ligand konsantrasyonları benzer olacaktır ve bu nedenle ikinci deneyde ligand tükenmesi yeterince hızlandırılmazsa kullanılamaz olacaktır.
>4. Veri İşleme
- DSC deney dosyalarını DSC veri analizi yazılımında açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve ham güç verilerini elektronik tablolar olarak dışa aktarın.
- Ham güç verilerini içeren elektronik tabloları, veri sığdırma için yazılıma aktarın.
- Taban çizgisi, serbest ve ligand'a bağlı biyomolekül deneylerinden tampon güç verilerini çıkararak numune verilerini çıkarın.
not: Termolabil ligand deneyi için, ilk ligandın konsantrasyonu her taramada azalmaktadır. Bu nedenle, arabellek taraması 1'i örnek tarama 1'den çıkarmak ve bu şekilde devam etmek idealdir. Kokain ile yapılan tampon taramalarının, ligand dönüşümü ilerledikçe önemli ölçüde değişmediğini ve bu nedenle, termolabil ligandına bağlı tüm verileri çıkarmak için tek bir termolabil ligand tampon taramasının kullanılabileceğini bulduk.
- Taban çizgisinden çıkarılan örnek güç verilerini ısı kapasitesine dönüştürün.
not: Dönüşüm, biyomolekülün tahmin edilebilecek kısmi özgül hacmini gerektirir.
5. Veri Analizi
- Kısa dengeleme süresi termolabil ligand'a bağlı ısı kapasitesi veri setini tek bir taban çizgisi, ligand konsantrasyonu, katlama ve ligand bağlama parametreleri setiyle küresel olarak sığdırın.
- Termolabil ligand dönüşümü için hız sabitini hesaplamak için uzun dengeleme süresi veri seti için küresel uyumu tekrarlayın.
