$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Rekabet Bağlama Testi için CXCL12, Test Tamponu ve Jurkat Hücrelerinin Hazırlanması
- Liyofilize reaktifi (-80 °C'de, karanlıkta saklanır) %0.01 (hacim/hacim) ile desteklenmiş ultra saf suda çözerekCXCL12 AF647'nin (20 μg/mL; bkz. Malzeme ve Reaktifler Tablosuna bakın) bir stok çözeltisi hazırlayın 20. Bu stok çözeltisinden tek kullanımlık alikotları -80 °C'de, ışıktan koruyarak saklayın.
- 200 mL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS, 10x, fenol kırmızısı ve sodyum bikarbonat olmadan, 1x nihai konsantrasyon) 40 mL HEPES (1 M, 20 mM nihai konsantrasyon) ekleyerek tahlil tamponu hazırlayın. 4 g (% 0.2 ağırlık / hacim) sığır serum albümini (BSA) ekleyin ve BSA'yı manyetik karıştırma yoluyla çözün. Son olarak, pH'ı 7.4'e ayarlayın (bunun için NaOH kullanın) ve çözeltiyi bir vakum manifoldu kullanarak 0.2 μm gözeneklerden süzün (Malzemeler ve Reaktifler Tablosuna bakın).
NOT: Bu tahlil tamponu, protokolün sonraki tüm adımlarında kullanılacaktır.
- Jurkat hücrelerinin sayısını ve canlılığını sayın. Bunun için hücre süspansiyonunun bir örneğini alın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin.
not: Rutin olarak, değişen konsantrasyonlarda hücre süspansiyonlarını sayabilen otomatik bir hücre canlılık analizörü (Malzemeler ve Reaktifler Tablosuna bakınız) kullanıyoruz. Hücre sayımı için, 0.5 mL hücre süspansiyonunu 1.5 mL PBS'de seyreltin (diğer dilüsyonlar, ör., 1.9 mL PBS'de 0.1 mL de mümkündür). Hücre sayılarını saymak ve eşit derecede iyi çalışması gereken canlılık için ticari olarak birkaç başka cihaz mevcuttur.
- İstenilen sayıda hücreyi (yani, testi tam bir 96 oyuklu plaka ile çalıştırmak için ~ 24 x 106 hücre) steril bir 50 mL tüpte santrifüjleme ile toplayın (kullanılan santrifüj tipi için Malzeme ve Reaktifler Tablosuna bakın) RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'de.
- Hücre peletini bozmadan süpernatanı nazikçe dökün. Taze tahlil tamponu ekleyin (ör., 20 mL) ve hücreleri hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
- Hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da tekrar santrifüjleyin.
- Süpernatanı tekrar dökün ve 5 x 106 hücre / mL'lik bir yoğunluk elde etmek için hücre peletini taze tahlil tamponunda yeniden süspanse edin.
2. Rekabet Bağlayıcı Deney
>NOT: Gerçek yarışma bağlama testi RT'de gerçekleştirilir ve steril olmayan koşullar altında gerçekleştirilebilir.
- İstenen konsantrasyonu elde etmek için incelenen bileşikleri tahlil tamponunda (bkz. 1.2) seyreltin. Ya ilk tarama için sabit bir bileşik konsantrasyonu hazırlayın (ör., 10 μM nihai konsantrasyon) ya da alternatif olarak, bileşiklerin daha ayrıntılı karakterizasyonu için bir seri seyreltme konsantrasyon serisi (ör., 1/3, 1/4 veya 1/5 seyreltme serisi, 1 μM'den başlayarak, nihai konsantrasyon). Bileşik çözeltinin nihayetinde tahlilde 2 kat seyreltileceğini unutmayın; Bu nedenle, 2x konsantre bir çözelti hazırlayın.
- 100 μL bileşik çözeltiyi (2x konsantre) önceden tanımlanmış bir deney düzenine göre (örneğin, Şekil 1C) 96 oyuklu şeffaf yuvarlak bir alt plakaya (Malzemeler ve Reaktifler Tablosuna bakınız) dağıtın.
NOT: Bu aşamada negatif ve pozitif kontrol numuneleri tahlile dahil edilir. Negatif kontrol numunesinde, 96 oyuklu plakanın kuyucuklarına bileşik yerine 100 μL tahlil tamponu eklenir. Pozitif kontrol numunesi için, bu adım sırasında bir tahlil tamponu da eklenir. Birkaç bileşiğin seyreltme serisinin test edildiği tipik bir deney düzeni için ayrıca Şekil 1C'ye bakınız.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak bir reaktif rezervuarından 96 oyuklu plakaya 50 μL hücre süspansiyonu (bkz. 1.7; 0.25 x 106 hücre) ekleyin. Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika inkübe edin.
- 50 μL floresan etiketli CXCL12 (yani, tahlil tamponunda 100 ng/mL CXCL12AF647, 4x konsantre, 25 ng/mL nihai konsantrasyon) benzer bir reaktif rezervuarından 96 oyuklu plakanın kuyucuklarına ekleyin. Karanlıkta RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
not: Negatif kontrol numuneleri için bunun yerine tahlil tamponu ekleyin. Bu nedenle, negatif kontrol numunelerinde tespit edilen floresan sinyali, otofloresan arka plan sinyaline karşılık gelecektir (Şekil 1A). Pozitif kontrol numuneleri için 50 μL/kuyucuk CXCL12AF647 ekleyin. Pozitif kontrol numuneleri, bileşiklerle ön inkübasyon yoluyla herhangi bir potansiyel inhibisyon dahil edilmediğinden tespit edilen maksimum floresan sinyalini verecektir (Şekil 1A).
- 96 oyuklu plakayı RT'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Plakayı ters çevirerek süpernatanı peletlenmiş hücrelerden çıkarın. Plakayı bir mendil üzerinde kurutun.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak bir reaktif rezervuarından kuyucuklara 200 μL taze tahlil tamponu ekleyin. Hemen devam edin.
- Plakayı RT'de 400 x g'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Plakayı ters çevirerek süpernatanı çıkarın ve tekrar bir doku üzerinde kurutun.
- Hücre peletini PBS içinde çözünmüş 200 μL% 1 paraformaldehit içinde nazikçe yeniden süspanse edin. Bu adım hücreleri düzeltecektir.
- Akış sitometrisi ile floresan miktarının belirlenmesi ile protokole hemen devam edin.
3. Örneklerin akış sitometrisi ile analizi
CXCL12AF647 lekeli ve fiksasyonlu hücreler artık akış sitometrisi kullanılarak analiz edilmeye hazırdır. Birkaç tip akış sitometresi kullanılabilir, ancak bunların uyarma için doğru lazerle (yani kırmızı lazer, uyarma aralığı ~ 630 nm) ve florofor tespiti için uygun filtrelerle (emisyon filtreleri ~ 660 nm) donatılması gerekir. Numuneleri 96 oyuklu plaka formatında işleme yeteneğine sahip olmaları gerekir. Uygun akış sitometrisi cihazlarının örnekleri Malzeme ve Reaktifler Tablosunda verilmiştir.
- Cihazı başlatın ve ilgili yazılımı açın (bkz. Malzeme ve Reaktifler Tablosu).
- Nokta lekesi biçiminde görselleştirilecek aşağıdaki hücresel parametreleri seçin: ileri saçılma (FSC), yan saçılma (SSC) ve florofor (CXCL12AF647) algılama kanalı.
not: FSC parametresi ile hücreler, algılanan ışık emilimi hücrenin çapı ile orantılı olduğu için boyutlarına göre ayırt edilir. 90°'lik bir açıyla ışık saçılımını ölçen SSC parametresi, hücrelerin tanecikliği hakkında bilgi sağlar.
- FSC ve SSC parametrelerine dayalı olarak tanımlanmış bir homojen hücre popülasyonunun geçitlenmesini gerçekleştirmek için bir numune (örneğin, bir negatif kontrol numunesi) seçin.
- Bu negatif kontrol örneğinden ~ 100 μL fiksasyonlu hücrelerin akış sitometresine otomatik enjeksiyonunu seçin. Enjeksiyondan önce "karıştırma" seçeneğini seçin ve 1,5 μL/sn'lik bir numune akış hızı kullanın.
- "Veri Al"ı seçerek bu örneği çalıştırın. Bu örnek için FSC ve SSC parametreleri şimdi ekranda görünecektir.
- Yazılımın geçit aracını seçin. FSC ve SSC nokta lekesi görselleştirmesine dayanarak, geçit ile homojen ve canlı bir hücre popülasyonunu önceden tanımlayın. Bunu yapmak için, bu iki boyuta dayalı olarak homojen olarak dağılmış tek hücreleri ("olaylar") içeren bir çokgen (yazılımın geçit aracını kullanarak) oluşturun.
not: Geçit prosedürü, daha fazla analiz için kullanılacak homojen ve canlı bir hücre popülasyonunu tanımlamayı amaçlar. Geçitleme, canlı hücrelerin çoğunluğunun FSC ve SSC parametrelerine dayalı olarak homojen bir hücre popülasyonu oluşturacağı varsayımına dayanır. Bu adımı gerçekleştirerek, hücresel kalıntılar, ölü hücreler ve hücre agregatları büyük ölçüde daha fazla analizden çıkarılabilir. Yolluk işleminin bir örneği Şekil 1B'de verilmiştir.
- Örnek başına 20.000 "olayı" (yani tek hücreleri) analiz etmek için seçin.
not: Bu, her numune için, önceden tanımlanmış kapıya giren 20.000 hücrenin sonunda analiz edileceği anlamına gelir. Her örnek için veri toplama, bu olay sayısı analiz edilene kadar devam edecektir.
- Çalıştırmayı başlatın ("Verileri Kaydet" i seçin). Akış sitometri cihazı şimdi her numune için ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) kaydederek tüm numuneleri tek tek analiz edecektir. Bu MFI, önceden tanımlanmış kapının içine giren 20.000 hücreye karşılık gelen ortalama floresan sinyaline karşılık gelir.
