1. Kimerik Yapıyı İfade Eden Bir Plazmidin Üretilmesi
>NOT: Amaç, fare CD3ζ zincirinin transmembran ve hücre içi alanlarına kaynaşmış ilgilenilen reseptörün hücre dışı alanını ifade eden bir plazmit oluşturmaktır (Şekil 1A).
- Sinyal peptidi de dahil olmak üzere ilgilenilen reseptörün hücre dışı alanının sırasını alın. Bu reseptörü eksprese etmesi beklenen DNA materyalini elde edin (örneğin, cDNA veya bir plazmit).
- Fare CD3ζ zincirinin transmembranını ve hücre içi alanlarını ifade eden DNA materyali elde edin (örneğin, cDNA veya bir plazmit).
- Şekil 1A'da gösterilen genel yapıya dayalı olarak füzyon proteininin dizisini tasarlayın. Tüm dizinin aynı kodon okuma çerçevesi içinde olduğundan emin olun. Bu dizi, uygun astarları tasarlamak ve nihai ürünü doğrulamak için kullanılır.
- Füzyon proteinlerinin her bir fragmanını ayrı ayrı amplifiye etmek için iki PCR reaksiyonu tasarlayın (Şekil 1B, 1C).
not: PCR reaksiyonları için spesifik koşullar (örn., uzama süresi ve tavlama sıcaklığı), belirli bir reseptör için tasarlanmış primerlerin doğasına bağlıdır.
- Reseptörün hücre dışı segmentini çoğaltın.
- Reseptörün sinyal peptidinin bir kısmını, bir Kozak konsensüs dizisini ve uygun bir kısıtlama bölgesini içeren 5' bir primer tasarlayın (Şekil 1B).
- Füzyon proteininin her iki parçasını da çevreleyen 3' bir astar tasarlayın (Şekil 1B). Örneğin, ilk tasarım için, bu 3' primer, reseptörün hücre dışı segmentinin son 20 baz çiftini ve CD3ζ segmentinin ilk 9 baz çiftini içerebilir.
not: 3' astarına bir kısıtlama bölgesi eklemeye gerek yoktur, çünkü bu astar kaynaşmış diziyi oluşturmak için kullanılacaktır ve ligasyon için kullanılmaz.
- CD3ζ segmentini yükseltin.
- Füzyon proteininin her iki kısmını da çevreleyen 5'lik bir astar tasarlayın (Şekil 1C). Örneğin, ilk tasarım için, 5' primer, reseptörün hücre dışı segmentinin son 9 baz çiftini ve CD3ζ segmentinin ilk 20 baz çiftini içerebilir.
not: 5' astarına bir kısıtlama bölgesi eklemeye gerek yoktur, çünkü bu astar kaynaşmış diziyi oluşturmak için kullanılacaktır ve ligasyon için kullanılmaz.
- CD3ζ dizisinin sonunu ve uygun bir kısıtlama bölgesini içeren 3' bir astar tasarlayın (Şekil 1C).
- Bu iki reaksiyonun her birindeki astar dizilerini, tavlama sıcaklığının her bir çiftte benzer olması için düzeltin (füzyon proteininin iki parçasının dizilerini içeren astarın, her reaksiyonda yalnızca dizinin bir kısmı ile tavlandığına dikkat edin).
- Hücre dışı reseptör segmentinin 5' primeri (Adım 1.4.1.1) ve CD3ζ segmentinin 3'ü (Adım 1.4.2.2) ile DNA şablonu olarak ilk iki reaksiyonun PCR ürünlerinin bir karışımının kullanıldığı ek bir PCR gerçekleştirin (Şekil 1.4.2.2) (Şekil 1D). Bu reaksiyon, son kaynaşmış diziyi oluşturmalıdır.
- Klonlama için her zamanki gibi devam edin.
- Nihai PCR ürününü hedef kesim vektörüne bağlayın (hedef vektör genellikle G418 ve ampisilin direncini ifade eden pcDNA3'tür).
- Bağlanmış vektörü yetkin bakterilere dönüştürün.
- Yetkili bakterilerin 50 μL'sini buz üzerinde çözdürün.
- Bağlanmış vektörü bakterilere ekleyin ve 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- 42 °C'de 45 saniye inkübe edin.
- Antibiyotiksiz 200 μL LB ekleyin.
- Sürekli çalkalayarak 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
- Uygun antibiyotiklerle bir LB plakasına tohumlayın (ör., nihai konsantrasyonu 0.1 mg / mL olan ampisilin çözeltisi).
- 5 mL LB'de (15 mL tüplerde) birkaç bakteri kolonisi toplayın ve büyütün.
- Ertesi gün, bir mini hazırlık kiti ile plazmitleri çıkarın.
- Gen ekini restriksiyon enzimleri ile analiz edin.
- İlgili kolonileri sıralayın ve dizinin ve okuma çerçevesinin doğru olduğunu doğrulayın (Adım 1.3'te belirtildiği gibi).
- Doğrulanmış plazmidi yetkin bakterilere dönüştürün.
- Yetkili bakterilerin 20 μL'sini buz üzerinde çözdürün.
- Bakterilere 1 μL plazmit ekleyin ve 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- 42 °C'de 45 saniye inkübe edin.
- Antibiyotiksiz 200 μL LB ekleyin.
- Sürekli çalkalayarak 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
- Uygun antibiyotiklerle bir bakteri üreme plakası üzerinde tohumlayın (ör., nihai konsantrasyonu 0.1 mg / mL olan ampisilin çözeltisi).
- Ertesi gün, 0.1 mg / mL ampisilin (~ 250 mL) içeren büyük bir LB kabında bir bakteri kolonisi büyütün.
- Ertesi gün, kit tarafından sağlanan özel talimatlara göre maxi hazırlık yapın.
not: Elektroporasyon prosedürü için, aşağıda detaylandırıldığı gibi büyük miktarda plazmit gereklidir.
2. Kimerik Proteini İfade Eden Plazmitin BW Hücrelerine Transfeksiyonu
NOT: Transfeksiyon için farklı yöntemler de kullanılabilir (örneğin, lentiviral enfeksiyon yoluyla). Elektroporasyondan önce, aşağıda açıklandığı gibi DNA'nın etanol çökeltmesini gerçekleştirin. Sonraki adımlar steril koşullar gerektirir.
- Bir gün önce, BW5147 hücrelerini ("BW hücreleri") elektroporasyon için hazırlayın. Plaka 10 mL 100.000 BW5147 hücre / mL (yani, toplam 10 x 106 hücre) ile %10 fetal buzağı serumu (FCS), %1 sodyum piruvat, %1 L-glutamin, %1 esansiyel olmayan amino asitler ve %1 penisilin-streptomisin ("tam ortam") ile desteklenmiş RPMI ile
.
- Füzyon proteinini ifade eden 100 μg pcDNA3 plazmidini 1.5-2 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve buna pH 5.3-5.5'te 3 M sodyum asetat ekleyin. Sodyum asetatın hacmi, 100 μg plazmidin hacminin 0.1'ine (% 10) karşılık gelmelidir; NaOH veya HCl ekleyerek sodyum asetatın pH'ını bir pH metre ile titre edin.
- Adım 2.2'de açıklandığı gibi plazmit ve sodyum asetat karışımına 2.5 hacim %100 etanol ekleyin (toplam plazmit ve sodyum asetat hacminin 2.5 katı). Gece boyunca -20 °C'de veya 70 °C'de 2 saat inkübe edin.
- BW hücreleri kaplandıktan 24 saat sonra, tüm BW hücrelerini (~ 100 mL) 2 50 mL'lik tüpte toplayın. Hücreleri 515 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Peletleri her iki tüpten 25 mL RPM'de - tek bir 50 mL tüpte yeniden süspanse edin. Örneğin, bir tüpün peletini 25 mL RPMI ile yeniden süspanse edin ve daha sonra bu sıvıyı diğer 50 mL'lik tüpte yeniden süspanse etmek için kullanın, böylece BW hücrelerinden gelen toplam pelet tek bir tüpte 25 mL ortamda yeniden süspanse edilir.
not: Serum elektroporasyona müdahale edebileceğinden ortam ilavesiz olmalıdır.
- Hücreleri 515 x g'da 5 dakika tekrar santrifüjleyin. Peleti 1 mL RPM'de yeniden süspanse edin ve içeriği buz üzerinde 0,4 cm'lik bir küvete aktarın.
- Etanol çökeltisine maruz kalan plazmiti (Adım 2.3) 16.000 x g ve 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
- 1 mL %70 etanol ile bir kez yıkayın ve 16.000 x g ve 4 ° C'de (tuzu yıkamak için) 20 dakika daha santrifüjleyin.
- Tüm etanolü çıkarın ve peletin hafifçe kurumasını bekleyin (yani, doku kültürü başlığındaki açık bir tüpte). Pelet, daha önce 60 °C'ye ısıtılmış 100 μL RPMI ile yeniden süspanse edin.
- Yeniden süspanse edilmiş plazmidi (Adım 2.8) küvetteki hücrelere ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 0.23 kV, 250 kapasitasyonda elektropoze edin. Bu ~ 4 ms sürmelidir.
- Elektroporasyonlu hücreleri 50 mL'lik bir tüpe aktarın, 50 mL tam ortam ekleyin ve 5,15 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücreleri 50 mL tam ortam ile yeniden süspanse edin.
- Elektroporasyonlu hücreleri 24 oyuklu kültür kaplarında (oyuk başına 1 mL, toplam ~ 50 kuyucuk için) kaplayın ve 37 ° C ve% 5 CO2'de 48 saat inkübe edin.
- Antibiyotiklerle transfekte edilmiş hücreleri seçin. 48 saat sonra, her bir oyuğa 10 mg / mL G418 ile takviye edilmiş 1 mL tam ortam ekleyin (bu aşamada, her bir oyuktaki son hacim 2 mL'dir ve her oyuktaki nihai G418 konsantrasyonu 5 mg / mL'dir).
not: Plazmit farklı bir antibiyotik direnci içeriyorsa, bu adımdan önce transfekte edilmemiş BW hücrelerini öldürmek için gereken antibiyotik konsantrasyonunu belirleyin.
- Her 48 saatte bir, kuyucuktaki ortamı karıştırmadan her bir oyuğun üst hacminin 1 mL'sini dikkatlice atın (BW hücreleri kuyunun dibinde olma eğilimindedir). Her oyuklu 5 mg / mL G418 ile takviye edilmiş tam ortam ekleyin, böylece her bir oyuktaki nihai hacim tekrar 2 mL olur.
- Kültür plakalarını tüm kuyucuklarda hücre büyümesi açısından düzenli olarak inceleyin.
not: Ortamın rengindeki sarıya bir değişiklik, büyüyen hücrelerin tanımlanmasına yardımcı olabilir; ancak, başlangıçta, G418'in kendisi nedeniyle ortam sarı olacaktır. Pozitif kuyuları tanımlayın (büyüyen hücrelere sahip kuyular). Bu kuyucuklar G418'e dirençlidir ve bu nedenle füzyon proteinini ifade etmesi beklenir. Bu süreç genellikle ~3 hafta sürer.
3. Pozitif kuyulardaki hücrelerde transfekte edilmiş reseptörün ekspresyonunun doğrulanması.
- Transfekte edilmiş BW hücrelerini, transfekte edilen reseptöre karşı spesifik bir antikor ile boyayın.
- Akış sitometrisi ile reseptörün ekspresyon seviyesini kontrol hücrelerinin (transfekte edilmemiş BW hücreleri) ekspresyonu ile karşılaştırın.
- Bir veya daha fazla kuyucuğun doğrulanmasından sonra, hücreleri hemen deneysel amaçlar için kullanın, kültürde büyütün veya gelecekteki uygulamalar için dondurun.
- Yeni bir deney yapmadan önce transfekte edilen reseptörün ekspresyonunu doğrulayın. Birkaç haftalık büyümeden sonra, stabil bir reseptör ekspresyonu olan G418'e sahip hücreler, G418 kültür ortamından çıkarılabilir.
4. Transfekte BW Hücrelerinin Hedeflerle İnkübasyonu
NOT: Transfekte edilmiş BW hücreleri ilk kez kullanıldığında, bunların ilgilenilen reseptörün bilinen bir ligandını eksprese eden hedefler üzerinde veya özellikle ilgilenilen reseptöre karşı yönlendirilmiş plakaya bağlı antikorlar üzerinde test edilmesi tercih edilir (çapraz bağlama deneyleri; aşağıya bakınız, bölüm 4.2.1.3).
- Tercihen, BW hücrelerini deneyden 24 saat önce bölün (örneğin, yeni bir 10 cm kültür plakasında kültürdeki 2 mL hücreye 10 mL tam ortam ekleyerek).
- Transfekte edilmiş BW hücrelerini hedefleriyle inkübe edin. Deneyi, boş bir vektörü (veya ebeveyn BW hücrelerini) ifade eden kontrol BW hücreleri üzerinde aynı anda gerçekleştirin. 96F plakalar tercih edilir (ancak 96U plakalar da kullanılabilir). Deneyi üç nüsha halinde gerçekleştirin. Tüm hücreleri tam ortamda askıya alın.
- Hedefleri hazırlayın. Hedefin türü, hedefin bir fonksiyonu olarak değişir ve hücreler, antikorlarla önceden inkübe edilmiş hücreler veya tek başına antikorlar olabilir. Bu sistem aynı zamanda hedef olarak bakterilerle de kullanılmıştır.
- Hedefler bölünen hücrelerse (yani hücre hatları), tahlilden önce bunları 6.000 rad'da ışınlayın. Hedef hücrelerin 50.000'ini 96 plakalık tek bir oyuğa (100 μL'lik bir hacimde) yerleştirin.
- İnsan FcyR'lerini eksprese eden antikorlar ve BW hücreleri ile yapılan deneyler için, hedef hücreleri 96 oyuklu bir plakada buz üzerinde bir antikor ile inkübe edin (örneğin, hedef hücrelerin 50 μL'si ve antikorun 50 μL'si; farklı antikor dozları test edilebilir).
- Hedef olarak tek başına antikorlar kullanılıyorsa (çapraz bağlama deneyleri), plakaya bağlı olmalıdırlar. Bu amaçla, önce antikorları 96F'lik bir plakada tam bir ortamda 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 1-2 saat inkübe edin (tipik bir başlangıç dozu, 50 μL'de 0.5 μg spesifik bir antikordur). Bağlanmamış antikorları çıkarmak için plakayı yıkayın.
not: Bu durumda, bir 96F plakası, antikorun plakaya bağlanmasını sağlayacaktır, bu da transfekte edilmiş BW hücrelerinin eklenmesinden sonra, transfekte edilen reseptörün aktivasyonuna yol açacaktır.
- BW hücrelerini (efektör hücreler) ekleyin. 50.000 BW hücresini 96 plakalık tek bir kuyucuğa (100 μL'lik bir hacimde) yerleştirin.
- Gerekirse her bir oyuktaki hacmi 200 μL'ye kadar tamamlayın.
- Plakaları 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 48 saat inkübe edin (bu süre kalibre edilebilir).
- 48 saat sonra, plakaları -20 ° C'de dondurun ve ELISA'dan önce çözdürün veya hemen ELISA için kullanın (sonraki adımlara bakın).
5. ELISA
- Bir ELISA plakasını bir anti-fare IL-2 antikoru (anti-mIL-2) ile kaplayın. Kuyucuk başına 50 μL 1x PBS (Fosfat tampon salin) hacmine 0.05 μg anti-mIL-2 yerleştirin. Kaplanmış ELISA plakasını anti-mIL-2 antikoru ile gece boyunca 4 ° C'de veya 37 ° C'de 2 h.
için inkübe edin
not: ELISA'yı inkübasyon adımından hemen sonra gerçekleştirmek için, ELISA plakası, BW hücrelerinin inkübasyon süresinin bitiminden 24 saat önce kaplanmalıdır.
- ELISA plakasındaki sıvıyı atın ve 1x PBS ve% 1 sığır serum albümininden (BSA) oluşan bir bloke edici çözelti (kuyu başına 200 μL) ekleyin. ELISA plakasını oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
- ELISA plakasını %0,05 PBS Tween solüsyonu ile üç kez yıkayın (ör., 1 litre 1x PBS'de 0,5 mL Tween-20).
- Hedefleriyle birlikte inkübe edilen BW hücrelerine sahip 96 plakasını alın (4.3). Plaka donmuşsa, tamamen çözün (örneğin, 37 ° C'de kısa bir inkübasyon ile). 96 oyuklu plakayı (5 dk, 515 x g) santrifüjleyin ve her oyuktaki 100 μL'lik süpernatanı önceden kaplanmış ve bloke edilmiş ELISA plakasına dikkatlice aktarın.
not: Süpernatant, hücrelerin alınmasını önlemek için her bir kuyucuğun kenarlarından toplanmalıdır.
- İstenirse, standart bir mIL-2 eğrisi oluşturmak için kaplanmış ELISA plakasının boş sıralarından birine tanımlanmış konsantrasyonlara sahip rekombinant mIL-2 ekleyin. Örneğin, 2.500 pg / mL'lik bir mIL-2 konsantrasyonundan başlayın ve ardından sonraki her kuyucukta% 50 azaltın; son kuyucuğa mIL-2 eklemeyin.
- ELISA plakasını gece boyunca 4 °C'de veya 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
- ELISA plakasını PBS Tween ile dört kez yıkayın.
- ELISA plakasına biotin anti-mouse IL-2 ekleyin. % 1 BSA ile 1 mL 1x PBS'de 1 μg antikor konsantrasyonu kullanın ve kuyu başına 100 μL'ye bölün.
- Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- ELISA plakasını PBS Tween ile altı kez yıkayın.
- HRP konjuge streptavidin ekleyin. % 1 BSA ile 1 mL PBSX1 içinde 1 μL streptavidin konsantrasyonu kullanın ve bunu kuyucuk başına 100 μL'ye bölün.
- Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- ELISA plakasını PBS Tween ile altı kez yıkayın.
- TMB substrat çözeltisinin oyuğu başına 100 μL ekleyin. TMB'yi eklerken zaman gecikmeleri nedeniyle kuyular arasındaki farkları en aza indirmek için bu aşamayı hızlı bir şekilde tamamlayın.
- ELISA plakasını 650 nm'de bir ELISA plaka okuyucu ile okuyun (sinyal zayıfsa okuma tekrarlanabilir).
