Reseptör-ligand etkileşimlerini ölçmek için biyomembran kuvvet probu

Özet

Kaynak: Chen, Y., et al., Floresan Biyomembran Kuvvet Probu: Tek Bir Hücrede Reseptör-ligand Kinetiğinin Eşzamanlı Kantitasyonu ve Bağlanma ile İndüklenen Hücre İçi Sinyalleme. (2015)

Bu videoda, reseptörler ve ligandlar arasındaki kuvvetleri ölçmek için biyomembran kuvvet probları (BFP'ler) kullanılmıştır. Bu teknik, prob boncukları üzerinde konjuge edilen pMHC ile hedef hücreler üzerindeki TCR'ler arasındaki bağları kırmak için gereken basıncı izleyerek etkileşimleri tespit edebilir.

Protokol

1. İnsan RBC'lerinin İzolasyonu, Biyotinilasyon ve Ozmolarite Ayarı

NOT: Adım 1.1, Kurumsal İnceleme Kurulu onaylı bir protokolle hemşire gibi eğitimli bir tıp uzmanı tarafından gerçekleştirilmelidir.

1. Bir parmak deliğinden 8-10 μl (bir damla) kan alın ve 1 ml karbonat / bikarbonat tamponuna ekleyin (Malzeme listesi). Karışımı nazikçe girdap haline getirin veya pipetleyin ve 900 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve bir kez daha yıkayın.
2. Küçük bir beherde 3.5-4 mg Biotin-PEG3500-NHS bağlayıcı ağırlığında (Malzeme listesi). Son konsantrasyonu 3 mg / ml yapmak için karbonat / bikarbonat tamponunda çözün.
3. 171 μl karbonat/bikarbonat tamponu, 10 μl RBC paketi ve 1049 μl Biotin-PEG3500-NHS bağlayıcı çözeltisini karıştırın ve RT'de 30 dakika inkübe edin. RBC'yi bir kez karbonat/bikarbonat tamponu ile ve ardından iki kez N2-5% tamponu ile yıkayın (Malzeme listesi).
4. Bu arada, bağlayıcı şişesini gevşetilmiş bir kapakla birlikte altta kurutucularla dolu bir cam vakumlu kurutucuya yerleştirin ve 5 dakika vakumlayın ve kurutucuyu argon ile doldurun. Kapağı sıkın ve şişeyi çıkarın. Şişeyi plastik parafin film (Malzeme listesi) ile kapatın, altta kurutucularla dolu bir kaba koyun ve -20 °C.
   'de saklayın. not: 1.2-1.4 (1.3'teki inkübasyon ve yıkama hariç) dahil olmak üzere Biotin-PEG3500-NHS bağlayıcısının kullanımını içeren adımların mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
5. 40 μg / ml'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için nistatini% N2-5 tamponuna seyreltin. 5 μl biyotinile RBC'yi 71.4 μl nistatin (Malzeme listesi) çözeltisi ile karıştırın ve 0 ° C'de 1 saat inkübe edin. N2-5% tampon ile iki kez yıkayın ve N2-5% tampon +% 0.5 BSA (Malzeme listesi) ile buzdolabında (4 ° C) saklayın.

2. Cam Boncuk Silanizasyonu

1. Boncuk Yüzeyinin Temizlenmesi
   1. 50 mg cam boncuk tozu tartın ve 500 μl DI su içinde tekrar süspanse edin.
   2. 50 ml'lik bir beherde 0,5 ml 0_H2O2(Malzeme listesi) 9,5 ml DI su ile karıştırın, ardından 2 ml konsantre _NH4OH(Malzeme listesi) ekleyin ve bu çözeltiyi sıcak bir plaka üzerinde bir kazana getirin.
   3. Cam boncukları kaynayan çözeltiye ekleyin ve 5 dakika daha kaynatmaya devam edin. Çözeltiyi her dakika hafifçe döndürün.
   4. Kaynattıktan sonra, bu sıcak boncuk süspansiyonunun ~ 5 ml'sini 15 ml'lik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve RT DI suyu ile doldurun. 5 dakika boyunca 3.500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve atın.
   5. 5 ml daha sıcak boncuk süspansiyonu aktarın ve yıkanmış boncuklara ekleyin, daha fazla DI su ile doldurun, iyice karıştırın ve tekrar santrifüjleyin. Yaklaşık 50 ml DI su kullanılana kadar bu işlemi tekrarlayın, bu da toplam 4 ila 5 kez yıkama olacaktır.
   6. Boncuk süspansiyonunu 1 ml'lik bir şişeye aktarın. Boncukları metanol ile (Malzeme listesi) 17.000 x g'da santrifüjleme ile 5 dakika 3 kez yıkamayı tekrarlayın ve son olarak boncukları 1 ml 0 metanol içinde yeniden süspanse edin.
2. Boncuk Yüzey Tiyolasyonu
   1. 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne 45.6 ml metanol, 0.4 ml asetik asit (Malzeme listesi), 1.85 ml DI su, 1.15 ml 3-Merkaptopropiltrimetoksisilan (MPTMS) (Malzeme listesi) ve 2.1'de hazırlanan 1 ml boncuk süspansiyonu ekleyin, daha sonra RT'de 3 saat inkübe edin.
   2. Reaksiyondan sonra, tüm reaktanları bir kez taze metanol ile yıkayarak çıkarın ve boncukları 500 μl metanole yeniden süspanse edin. Bu konsantre cam boncuk süspansiyonunu, vidalı kapaklı 20 kuru ve temiz cam şişeden oluşan bir sete eşit olarak bölün. Bir kuru argon jeti kullanarak metanolü buharlaştırın ve her bir şişenin yanlarında ince bir kuru boncuk tabakası oluşturacak şekilde şişeleri yavaşça döndürün.
   3. Boncuk şişelerini önceden ısıtılmış 120 °C'de 5 dakika kurutma fırınına koyun ve ardından kapakları çıkarın ve hızlı bir şekilde gevşek bir şekilde yerleştirin. Şişeleri altta kurutucularla dolu bir cam vakumlu kurutucuya yerleştirin ve kurutucuyu soğuyana kadar bir vakum pompası ile vakumlayın.
   4. Desikatörü normal atmosfer basıncına getirmek için vakumlu desikatörü kuru argon ile temizleyin. Kurutucu kapağını çıkarın ve flakon üzerindeki kapak(lar)ı hızla yeniden sıkın. Şişeleri plastik parafin film ile kapatın ve RT'de kuru ve karanlık bir saklama kutusunda saklayın.
   5. Hemen kullanımdan sonra, bir şişe kuru boncuk alın ve bir kez fosfat tamponu ile yıkayın (Malzeme listesi), 50 μl fosfat tamponuna yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de saklayın. Bu konsantre boncuk hazırlığı, aşağıdaki adımlarda "MPTMS boncukları" olarak anılacaktır.
      not: Uygun depolama ile MPTMS boncukları üç aya kadar işlevsel kalabilir.

3. Boncuk İşlevselleştirme

1. Boncuklar Üzerine Kovalent Kaplama Proteinleri
   1. Belirli bir hacimde (örneğin, 2.5 μl) protein stoğu alın ve Çözelti 1.
      not: Hacim, stok konsantrasyonuna ve boncukların yüzeyindeki proteinin istenen nihai bölge yoğunluğuna bağlıdır.
   2. Küçük bir beherde 2-3 mg MAL-PEG3500-NHS bağlayıcı (Malzeme listesi) tartın ve 0.231 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için karbonat / bikarbonat tamponu ile çözün.
   3. Çözelti 1'i, 3.1.2'de hazırlanan eşit hacimde bağlayıcı çözelti ile karıştırın. Çözelti 2'yi yapmak için karışımı RT'de 30 dakika inkübe edin.
   4. Bu arada, bağlayıcı şişesini gevşetilmiş bir kapakla birlikte altta kurutucularla dolu bir cam vakumlu kurutucuya yerleştirin ve 5 dakika vakumlayın ve kurutucuyu argon ile doldurun. Kapağı sıkın ve şişeyi çıkarın. Şişeyi plastik parafin film ile kapatın, altta kurutucularla dolu bir kaba koyun ve -20 °C'de saklayın.
      not: 3.1.2-3.1.4 (3.1.3'teki inkübasyon hariç) dahil olmak üzere MAL-PEG3500-NHS bağlayıcısının kullanımını içeren adımların mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
   5. 5 μl MPTMS boncuklarını Çözelti 2 ile karıştırın ve 250 μl'lik bir nihai hacim elde etmek için fosfat tamponu (Malzeme listesi) ekleyin.
   6. Boncukları gece boyunca RT'de inkübe edin, 3 kez fosfat tamponu ile yıkayın ve 100 μl fosfat tamponuna yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de saklayın.
2. Protein/Streptavidin (SA) Kaplı Boncukların Hazırlanması
   1. 3.1.1-3.1.4 protokolünü takip edin.
   2. 5 μl MPTMS boncuklarını Çözelti 2 ve 5 μl 4 mg / ml Streptavidin-Maleimid (SA-MAL) (Malzeme listesi) çözeltisi ile karıştırın ve ardından 250 μl'lik bir nihai hacim elde etmek için fosfat tamponu ekleyin.
   3. Boncukları gece boyunca RT'de inkübe edin, 3 kez fosfat tamponu ile yıkayın ve son olarak 100 μl fosfat tamponuna yeniden süspanse edin ve 4 °C'de saklayın.
3. Streptavidin Cam Boncuklar Üzerine Kaplanması
   1. 5 μl MPTMS boncuklarını 5 μl 4 mg / ml SA çözeltisi ile karıştırın ve 140 μl fosfat tamponu ekleyin.
   2. Boncukları gece boyunca RT'de inkübe edin, 3 kez fosfat tamponu ile yıkayın, 50 μl fosfat tamponuna yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de saklayın.
4. SA Kaplı Boncukların Biyotinillenmiş Protein ile Kaplanması
   1. 5 μl SA kaplı boncukları proteinle karıştırın (istenen kaplama yoğunluğuna bağlı olarak hacim) ve nihai hacmin 100 μl olması için fosfat tamponu ekleyin.
   2. Karışımı gece boyunca 4 ° C'de veya RT'de 3 saat inkübe edin, 3 kez fosfat tamponu ile yıkayın ve 50 μl fosfat tamponuna yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de saklayın.

4. Hücre Hazırlama

NOT: Hücreleri saflaştırmak için, kullanılan hücre tipine karşılık gelen standart hücre saflaştırma protokollerini izleyin, örneğinample, T hücreleri veya belirli hücre hatları.

1. fBFP deneyleri için, hücre süspansiyonu hazırlandıktan sonra, 2 μM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için DMSO'da çözünmüş Fura2-'yi (Malzeme listesi) hücre süspansiyonuna ekleyin, RT'de 30 dakika inkübe edin ve ardından bir kez yıkayın. Bu floresan yüklü hücre süspansiyonunu kullanana kadar karanlıkta tutun.

5. Mikropipetler ve Hücre Odası için Hazırlık

1. Mikropipetlerin Hazırlanması
   1. Uzun kılcal cam tüpleri (Malzeme listesi) bir cam kesici ile yaklaşık 3 inç uzunluğunda kısa parçalar halinde kesin. Tek parçayı mikropipet çekicisine (Malzeme listesi) monte edin, "Çek" düğmesine tıklayın, böylece kılcal damarın ortası makine tarafından ısıtılacak ve kılcal damar iki uçtan çekilerek keskin uçlu iki kılcal damar (ham mikropipetler) yapılacaktır.
      not: Ürün kılavuzunu takip ederek, ham pipetin istenen morfolojisi 6-8 mm konikliğe ve 0,1-0,5 μm uca sahiptir.
   2. Mikropipet forge'un pipet tutucusuna ham bir pipet takın (Malzeme listesi). Dövme üzerindeki cam küreyi eritmek için ısıtın. Ham pipetin ucunu cam kürenin içine sokun. Cam küreyi soğutun ve ham pipeti dışarıdan kırmak ve ucunu kürenin içinde bırakmak için çekin. İstenilen uç deliği elde edilene kadar bu işlemi tekrarlayın.
      not: Mikropipet ucu iç çapı örnekleri: RBC için 2.0-2.4 μm, boncuk için ~1.5 μm, T hücresi için ~2-4 μm ve hibridoma hücresi için -7 μm.
2. Bir Hücre Odası İnşa Etmek
   NOT: hücre odası, iki parça metal kareden (bakır/alüminyum) ve bunları birbirine bağlayan bir saptan oluşan ev yapımı bir hazne tutucusu temelinde inşa edilmiştir (Şekil 1D).
3. Bir cam kesici kullanarak 40 mm x 22 mm x 0,2 mm'lik bir lameli iki adet 40 mm x 11 mm x 0,2 mm parçaya kesin (lamel 1 ve 2). Lamel 1'i hazne tutucunun üst tarafına, iki metal kareyi köprüleyecek şekilde gres ile yapıştırın ve benzer şekilde lamel 2'yi alt tarafa yapıştırın, bu da paralel bir lamel hücre odası oluşturacaktır (Şekil 1D).
4. İki lamel arasına 200 μl deneysel tampon enjekte etmek için bir pipet kullanın. Tamponun her iki lamele de takıldığından emin olun. Tamponun haznenin her iki ucuna da temas etmesini sağlamak için hazneyi hafifçe döndürün ve sallayın.
5. Deneysel tampon bölgesini çevreleyen haznenin her iki tarafına dikkatlice mineral yağ enjekte edin, böylece tamponu açık havadan kapatın. Tampon bölgesinin sırasıyla üst, orta ve alt bölgelerine prob boncuklarının (örneğin, pMHC kaplı boncuklar), RBC'lerin ve hedeflerin (örneğin, T hücreleri) süspansiyonlarını enjekte edin.

4. BFP deneyi

1. Mikroskobu (Malzeme listesi) ve ışık kaynağını açın. Odayı ana mikroskop tablasına yerleştirin (Şekil 1A, D).
2. BFP'nin üç mikropipetini de takın (Şekil 1D. Sol: sonda, bir RBC almak için, sağ: hedef, bir hücre veya boncuk almak için, sağ alt: yardımcı, bir boncuk almak için).
   1. Bir mikropipeti deneysel bir tamponla doldurmak için bir mikro enjektör (Malzeme listesi) kullanın. Pipet tutucuyu (Malzeme listesi) çıkarın ve ucundan su damlamasına izin vermek için daha düşük bir yerde tutun. Mikropipeti hızlı bir şekilde tutucu ucuna yerleştirin ve yerleştirme sırasında mikropipetin içine hava kabarcığı girmediğinden emin olun. Tutucu vidayı sıkın.
   2. Her pipet tutucuyu ilgili mikro manipülatöre monte edin. Mikropipeti, uçları hazne tampon alanına girecek şekilde hazneye doğru itin. Mikropipetin konumunu ayarlayın ve mikroskop görüş alanı altında bulun.
3. Üç elementin (RBC'ler, hedefler ve prob boncukları) kolonilerini tek tek bulmak için hazne tutucu aşamasının etrafında hareket edin. Mikropipetin ucunun bir hücreye/boncuğa yaklaşmasına izin vermek için manipülatörlerin düğmelerini çevirerek ilgili mikropipetin konumunu ayarlayın. İlgili mikropipetin içindeki basıncı ayarlayarak hücreyi/boncuğu aspire edin. Her üç mikropipet de karşılık gelen elemanlarını yakalayacaktır.
4. Deneyin gerçekleştirileceği enjekte edilen elementlerin kolonilerinden uzakta açık bir alan bulmak için oda tutucu aşamasının etrafında hareket edin. Bilgisayar programındaki görüntüyü bilgisayar ekranında görselleştirmek için mikroskop görsel modunu değiştirin. Pipet uçlarındaki üç öğeyi de programın görüş alanına taşıyın.
5. Prob boncuğunu ve RBC'yi hizalayın ve prob boncuğunu RBC'nin tepesine dikkatlice hareket ettirin, boncuğu RBC'ye kısa bir süre bastırın ve yavaşça geri çekin. Boncuğu RBC tepesine yapıştırılmış halde kalacak şekilde nazikçe üflemek için yardımcı mikropipetin basıncını ayarlayın (Şekil 1F). Yardımcı mikropipeti uzaklaştırın ve hedef ile prob boncuğunu hizalayın (Şekil 2A).
6. Programda, görüş alanı penceresinde, prob mikropipetinin (Rp), RBC'nin (R0), RBC ile prob boncuğu arasındaki dairesel temas alanının (Rc) ilgili yarıçaplarını ölçmek için programdaki araçları kullanın, bu da RBC'nin (k) yay sabitinin aşağıdaki denklemle tahmin edilmesini sağlar, burada Δp, prob pipet ucundaki aspirasyon basıncıdır. Not: Hooke yasasından, bağlanma kuvvetinin, F'nin, yay sabitinin çarpımı ve prob boncuğunun (d) yer değiştirmesi ile ölçülebileceği, yani F = d (Şekil 2C).
   
7. İstenen RBC yay sabitini programa girin (Lütfen Protokol bölüm 4.6'ya bakın. Yay sabiti tipik olarak kuvvet kelepçesi testi ve yapışma frekansı deneyi için 0,25 veya 0,3 pN/nm ve termal dalgalanma deneyi için 0,1 pN/nm olarak ayarlanır), bu da bir santimetre su biriminde gerekli aspirasyon basıncını döndürür. Gerekli aspirasyon basıncına ulaşılana kadar probun pipetine bağlanan su deposunun yüksekliğini ayarlayın.
8. RBC tepesi boyunca yatay bir çizgi çizin, bu çizgi boyunca bitişik pencerede her pikselin parlaklığını (gri tonlama değeri) gösteren bir eğri verecektir. Eşik çizgisini, eğrinin derinliğinin yaklaşık yarısı kadar olacak şekilde sürükleyin (Şekil 2A, B).
   not: Parlaklık eğrisinde eşik çizgisinin altındaki minimum nokta, boncuk sınırının konumunu gösterir, bu nedenle yalnızca bir yerel minimuma izin verilir. Şu anda iki veya daha fazla yerel minimum varsa, görüntünün optimal olmadığını gösterir (muhtemelen görüntünün odak dışında olması veya prob boncuğu ile RBC arasındaki zayıf hizalama nedeniyle).
9. İstenen deney modunu seçin: termal dalgalanma testi, yapışma frekansı testi veya kuvvet kelepçesi testi. Parametreleri istediğiniz gibi ayarlayın (örneğin, çarpma kuvveti = 15 pN, yükleme hızı = 1.000 pN/s, temas süresi = 1 sn, sıkıştırma kuvveti = 20 pN (kuvvet kelepçesi testi için), vb.).
   1. Programın hedef pipeti hareket ettirmesine ve hedefi probla temas ettirip çıkarmasına izin veren "Başlat"a tıklayın (ayrıntılar için Temsili Sonuçlar bölümüne bakın). Veri toplama, prob boncuğunun konumunu gerçek zamanlı olarak kaydeden paralel olarak gerçekleştirilecektir. "Deneyi durdur" düğmesine tıklayarak programı durdurun, bu sırada elde edilen verilerin kaydedilmesine izin vermek için bir pencere açılacaktır.

Sonuçlar

Şekil 1: fBFP montajı.

(A) fBFP donanım sistemine genel bakış resmi. (B) fBFP donanım sisteminin şematik bir çizimi. (C) Yüksek hızlı kameranın (mavi) ve floresan kameranın (beyaz) monte edildiği çift kamera sistemi "DC2" (turuncu). (D) Bir deney odasını ve üç mikropipet manipülasyon sistemini uyarlayan mi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sodyum Fosfat Monobazik Monohidrat (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638 Serisi	Fosfat tamponu hazırlama
Anhy. Sodyum Fosfat Dibazik (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907 Serisi	Fosfat tamponu hazırlama
Sodyum Karbonat (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127 Serisi	Karbonat / bikarbonat tampon hazırlama
Sodyum Bikarbonat (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761 Serisi	Karbonat / bikarbonat tampon hazırlama
Sodyum klorür (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653 Serisi	N2-5% tampon hazırlama
Potasyum klorür (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541 Serisi	N2-5% tampon hazırlama
Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655 Serisi	N2-5% tampon hazırlama
Sakaroz	Sigma-Aldrich	S0389 Serisi	N2-5% tampon hazırlama
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Boncuk işlevselleştirmesi
Biyotin-PEG3500-NHS	JenKem	A5026-1	RBC biyotinilasyonu
Nistatin	Sigma-Aldrich	N6261	RBC ozmolarite ayarı
Amonyum Hidroksit (NH4OH)	Sigma-Aldrich	A-6899	Cam kürecik silanizasyonu
metanol	BDH (Türkçe)	67-56-1	Cam kürecik silanizasyonu
%30 Hidrojen Peroksit (H2O2)	J. T. Barker	Ocak-86	Cam kürecik silanizasyonu
Asetik Asit (Buzul)	Sigma-Aldrich	ARK2183	Cam kürecik silanizasyonu
3-Merkaptopropiltrimetoksisilan (MPTMS)	Uct Spesiyaliteleri, llc	4420-74-0	Cam kürecik fonksiyonelleştirmesi
Borosilikat Cam boncuklar	Distrilab Parçacık Teknolojisi	9002	Cam kürecik fonksiyonelleştirmesi
Streptavidin-Maleimid	Sigma-Aldrich	S9415 Serisi	Cam kürecik fonksiyonelleştirmesi
Bsa	Sigma-Aldrich	A0336	Ligand işlevselleştirme
Fura2-	Yaşam Teknolojileri	F-1201	Hücre içi kalsiyum floresan boya yüklemesi
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Hücre içi kalsiyum floresan boya yüklemesi
Kuantibrit PE Boncuklar	BD Biyolojik Bilimler	340495	Yoğunluk ölçümü
Kılcal Boru 0.7-1.0 mm x 30 inç	Kimble Kovalamacası	46485-1	Mikropipet yapımı
Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme	Sutter Enstrümanı	P-97	Mikropipet yapımı
Narishige (Narishig)	Narishige (Narishig)	Narishige (Narishig)	Mikropipet yapımı
Madeni Yağ	Balıkçı Bilimsel	BP2629-1	Oda montajı
Mikroskop Kapak Camı	Balıkçı Bilimsel	12-544-G	Oda montajı
Mikro enjektör	Dünya Hassas Aletler	MF34G-5	Oda montajı
1 ml şırınga	Bd	309602	Oda montajı
Mikropipet tutucu	Narishige (Narishig)	HI-7	Oda montajı
Mikroskop (TiE ters çevrilmiş)	Nikon	MEA53100	BFP sistemi
Objektif CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)	Nikon	MRH00401	BFP sistemi
Kamera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono	Graftek Görüntüleme	02-2020C	BFP sistemi
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Montajlı, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC	Graftek Görüntüleme	02-2185A	BFP sistemi
Yüksek çözünürlüklü uzaktan kumandalı manuel mikron altı prob kafası	Karl Suss ·	PH400	BFP sistemi
Titreşim önleyici tabla (5' x 3')	TMC (Türkçe)	77049089	BFP sistemi
3D manuel çeviri aşaması	Newport	462-XYZ-M
SolidWorks 3D CAD yazılımı	SolidWorks 3D CAD yazılımı	Sürüm 2012 SP5	BFP sistemi
LabVIEW yazılımı	Ulusal Enstrümanlar	Versiyon 2009	BFP sistemi, BFP programı
3D piezo çeviri aşaması	Fizik Enstrüman	M-105.3P	BFP sistemi
Doğrusal piezo aktratör	Fizik Enstrüman	P-753.1CD	BFP sistemi
Karbonat/bikarbonat tamponu (pH 8.5)			8,4 g/L sodyum karbonat (Na2CO3), 10,6 g/L sodyum bikarbonat (NaHCO3)
N2-5% tampon (pH 7.2)			27,6 g/L NaFosfat monobazik (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfat dibazik (Na2HPO4)
			20.77 g/L potasyum klorür (KCl), 2.38 g/L sodyum klorür (NaCl), 0.13 g/L potasyum fosfat monobazik (KH2PO4), 0.71 g/L anhidrat. sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4), 9.70 g/L sükroz