Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
893 görüntülenme
⸱
8 Temmuz 2025
Kaynak: Chen, Y., et al., Floresan Biyomembran Kuvvet Probu: Tek Bir Hücrede Reseptör-ligand Kinetiğinin Eşzamanlı Kantitasyonu ve Bağlanma ile İndüklenen Hücre İçi Sinyalleme. (2015)
Bu videoda, reseptörler ve ligandlar arasındaki kuvvetleri ölçmek için biyomembran kuvvet probları (BFP'ler) kullanılmıştır. Bu teknik, prob boncukları üzerinde konjuge edilen pMHC ile hedef hücreler üzerindeki TCR'ler arasındaki bağları kırmak için gereken basıncı izleyerek etkileşimleri tespit edebilir.
1. İnsan RBC'lerinin İzolasyonu, Biyotinilasyon ve Ozmolarite Ayarı
NOT: Adım 1.1, Kurumsal İnceleme Kurulu onaylı bir protokolle hemşire gibi eğitimli bir tıp uzmanı tarafından gerçekleştirilmelidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Şekil 1: fBFP montajı.
(A) fBFP donanım sistemine genel bakış resmi. (B) fBFP donanım sisteminin şematik bir çizimi. (C) Yüksek hızlı kameranın (mavi) ve floresan kameranın (beyaz) monte edildiği çift kamera sistemi "DC2" (turuncu). (D) Bir deney odasını ve üç mikropipet manipülasyon sistemini uyarlayan mi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sodyum Fosfat Monobazik Monohidrat (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 Serisi | Fosfat tamponu hazırlama |
| Anhy. Sodyum Fosfat Dibazik (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 Serisi | Fosfat tamponu hazırlama |
| Sodyum Karbonat (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 Serisi | Karbonat / bikarbonat tampon hazırlama |
| Sodyum Bikarbonat (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 Serisi | Karbonat / bikarbonat tampon hazırlama |
| Sodyum klorür (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 Serisi | N2-5% tampon hazırlama |
| Potasyum klorür (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 Serisi | N2-5% tampon hazırlama |
| Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 Serisi | N2-5% tampon hazırlama |
| Sakaroz | Sigma-Aldrich | S0389 Serisi | N2-5% tampon hazırlama |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Boncuk işlevselleştirmesi |
| Biyotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biyotinilasyonu |
| Nistatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC ozmolarite ayarı |
| Amonyum Hidroksit (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Cam kürecik silanizasyonu |
| metanol | BDH (Türkçe) | 67-56-1 | Cam kürecik silanizasyonu |
| %30 Hidrojen Peroksit (H2O2) | J. T. Barker | Ocak-86 | Cam kürecik silanizasyonu |
| Asetik Asit (Buzul) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Cam kürecik silanizasyonu |
| 3-Merkaptopropiltrimetoksisilan (MPTMS) | Uct Spesiyaliteleri, llc | 4420-74-0 | Cam kürecik fonksiyonelleştirmesi |
| Borosilikat Cam boncuklar | Distrilab Parçacık Teknolojisi | 9002 | Cam kürecik fonksiyonelleştirmesi |
| Streptavidin-Maleimid | Sigma-Aldrich | S9415 Serisi | Cam kürecik fonksiyonelleştirmesi |
| Bsa | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand işlevselleştirme |
| Fura2- | Yaşam Teknolojileri | F-1201 | Hücre içi kalsiyum floresan boya yüklemesi |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Hücre içi kalsiyum floresan boya yüklemesi |
| Kuantibrit PE Boncuklar | BD Biyolojik Bilimler | 340495 | Yoğunluk ölçümü |
| Kılcal Boru 0.7-1.0 mm x 30 inç | Kimble Kovalamacası | 46485-1 | Mikropipet yapımı |
| Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme | Sutter Enstrümanı | P-97 | Mikropipet yapımı |
| Narishige (Narishig) | Narishige (Narishig) | Narishige (Narishig) | Mikropipet yapımı |
| Madeni Yağ | Balıkçı Bilimsel | BP2629-1 | Oda montajı |
| Mikroskop Kapak Camı | Balıkçı Bilimsel | 12-544-G | Oda montajı |
| Mikro enjektör | Dünya Hassas Aletler | MF34G-5 | Oda montajı |
| 1 ml şırınga | Bd | 309602 | Oda montajı |
| Mikropipet tutucu | Narishige (Narishig) | HI-7 | Oda montajı |
| Mikroskop (TiE ters çevrilmiş) | Nikon | MEA53100 | BFP sistemi |
| Objektif CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP sistemi |
| Kamera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Görüntüleme | 02-2020C | BFP sistemi |
| Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Montajlı, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Görüntüleme | 02-2185A | BFP sistemi |
| Yüksek çözünürlüklü uzaktan kumandalı manuel mikron altı prob kafası | Karl Suss · | PH400 | BFP sistemi |
| Titreşim önleyici tabla (5' x 3') | TMC (Türkçe) | 77049089 | BFP sistemi |
| 3D manuel çeviri aşaması | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD yazılımı | SolidWorks 3D CAD yazılımı | Sürüm 2012 SP5 | BFP sistemi |
| LabVIEW yazılımı | Ulusal Enstrümanlar | Versiyon 2009 | BFP sistemi, BFP programı |
| 3D piezo çeviri aşaması | Fizik Enstrüman | M-105.3P | BFP sistemi |
| Doğrusal piezo aktratör | Fizik Enstrüman | P-753.1CD | BFP sistemi |
| Karbonat/bikarbonat tamponu (pH 8.5) | 8,4 g/L sodyum karbonat (Na2CO3), 10,6 g/L sodyum bikarbonat (NaHCO3) | ||
| N2-5% tampon (pH 7.2) | 27,6 g/L NaFosfat monobazik (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfat dibazik (Na2HPO4) | ||
| 20.77 g/L potasyum klorür (KCl), 2.38 g/L sodyum klorür (NaCl), 0.13 g/L potasyum fosfat monobazik (KH2PO4), 0.71 g/L anhidrat. sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4), 9.70 g/L sükroz |
