Rakip GTPaz Bağlayıcı Protein Ortaklarını İncelemek için Rekabet Bağlayıcı Test

Özet

Kaynak: Williamson, R. C., et al. Rekabet Tahlilleri Kullanılarak GTPaz Bağlayıcı Proteinlerin Afinitesinin Karşılaştırılması. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, GTPaz bağlayıcı protein ortaklarını incelemek için bir rekabet testini göstermektedir. Manyetik boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş nükleotid bağlı GTPaz proteini kullanılarak, GTPaz üzerindeki aynı bağlanma bölgesi için etkileşen iki protein ortağı arasındaki rekabetçi bağlanma, protein ortaklarının bağlanma afinitelerini değerlendirmek için incelenebilir.

Protokol

>1. GST etiketli GTPase'nin saflaştırılması

1. 500 ml otoindüksiyon ortamında (25 mM Na₂HPO₄, 25 mM KH₂PO₄, 50 mM NH₄, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Na₂SO₄, 2 mM MgSO 4, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, %0,5 Gliserol, %0,05 Glikoz, %0,2 Laktoz, 5 g Tripton, 2,5 g Maya Özütü, 100 μg/ml Ampisilin).
2. 10.000 x g, 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile bakterileri hasat edin.
3. Bakteriyel peleti 20 ml protein ekstraksiyon reaktifi, 1x proteaz inhibitörü içinde yeniden süspanse edin ve inversiyon ile RT'de 20 dakika inkübe edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Böcek avcısı	Yenilikçi	70584-3
TAM proteaz inhibitörü	Roche	05 056 489 001
Glutatyon manyetik boncuklar	delmek	88821
Polietilenimin, dallı, ortalama Mw ~ 25.000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM (OPIMEM)	Yaşam Teknolojileri	31985-047
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Medyası	Sigma Aldrich	D5796
Fetal Sığır Serumu	Yaşam Teknolojileri	10270-1-6
L-Glutamin	Yaşam Teknolojileri	25030-024
GFP-Trap_A	Kromotec	GTA-20
GSYİH	Sigma Aldrich	G7127	Son derece kararsız. Aliquot ve sulandırıldıktan hemen sonra -80'de saklayın
GTPγS	Sigma Aldrich	G8634	Son derece kararsız. Aliquot ve sulandırıldıktan hemen sonra -80'de saklayın
Engelleme Tamponu	Sigma Aldrich	B6429
Ara-20	Sigma Aldrich	P9416
Anti-GFP antikoru	Canlı Renkler	632592	1/1000 seyreltmede kullanın
DyLight 800 konjuge keçi anti-tavşan ikincil antikoru	Balıkçı Bilimsel	10733944
Odyssey SA Kızılötesi Görüntüleme Sistemi	Li-kor	9260-11 BİLGİSAYAR

numaralı telefondan temin edilmiştir. · · Serisi Serisi · Serisi · Serisi · Serisi · Serisi