$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. GST etiketli GTPase'nin saflaştırılması
- 500 ml otoindüksiyon ortamında (25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4, 50 mM NH 4 Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM MgSO 4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, %0,5 Gliserol, %0,05 Glikoz, %0,2 Laktoz, 5 g Tripton, 2,5 g Maya Özütü, 100 μg/ml Ampisilin).
- 10.000 x g, 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile bakterileri hasat edin.
- Bakteriyel peleti 20 ml protein ekstraksiyon reaktifi, 1x proteaz inhibitörü içinde yeniden süspanse edin ve inversiyon ile RT'de 20 dakika inkübe edin.
- Lizatı 30 dakika boyunca 40.000 x g'da santrifüjleme ile berraklaştırın.
- Fosfat tamponlu salin (PBS: 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl) ile yıkanmış 2 ml glutatyon manyetik boncuk ekleyin.
- 2 saat inkübe edin, 4 ° C'de ters çevirerek karıştırın.
- Protein yüklü boncukları 10 ml PBS ile dört kez yıkayın ve her adımda boncukları çökeltmek için manyetik bir parçacık sıralayıcı kullanın.
- Protein yüklü boncukları 2 ml PBS'de yeniden süspanse edin ve ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C'de 100 μl'lik alikotlarda saklayın.
2. GTPaz bağlayıcı proteinlerin ekspresyonu
- Deneyden bir gün önce, her bir GTPaz bağlayıcı proteinin yeşil floresan proteini (GFP) etiketli versiyonlarını aşağıdaki gibi ayrı bir 75cm2'lik HEK293T şişesine kodlayan plazmitleri transfekt. Nükleotid yüklemesinin doğrulanması için, GFP etiketli TrioD1'i üçüncü bir 75cm2'lik HEK293T şişesine aktarın.
- Polietilamini 100 μl steril 150 mM NaCl içinde 1 mg / ml'ye seyreltin.
- 223 μl azaltılmış serum ortamına 27 μl seyreltilmiş polietilamin ekleyin.
- 250 μl indirgenmiş serum ortamına 12 μg plazmit DNA ekleyin.
- Her tüpü RT'de 2 dakika inkübe edin.
- Polietilamin ve DNA karışımlarını tek bir tüpte birleştirin ve 2 dakika boyunca girdap yapın.
- RT'de 15-20 dakika inkübe edin.
- Büyüme ortamını (Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı, %10 fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin, antibiyotik yok) %90 birleşik HEK293T üzerine 5 ml taze büyüme ortamı ile değiştirin.
- Kombine polietilen/DNA karışımını şişeye ekleyin ve O/N'yi 37 °C, %5 CO2'de inkübe edin.
3. GTPaz bağlayıcı proteinlerin saflaştırılması
- Transfekte edilmiş hücrelerin şişelerini PBS'de durulayın ve şişeyi 5 dakika boyunca boşaltın, serbest sıvıyı aspire edin.
- 500 μl lizis tamponundaki (50 mM Tris-HCl (pH 7.8)% 1 Nonidet P-40, 1x proteaz inhibitörü) hücreleri bir mikrofüj tüpüne kazıyın.
- Hücreleri 4 ° C'de 30 dakika ters çevirerek karıştırın.
- Liziz sırasında, iki lot 40 μl GFP-Trap boncuğu taze lizis tamponu ile üç kez yıkayın, boncukları yıkamalar arasında 2 dakika boyunca 2.700 x g'da çökeltin.
- Lizatları 10 dakika boyunca 21.000 x g'da santrifüjleme ile berraklaştırın.
- Yıkanmış GFP tuzağı boncuklarını ayırmak için rakip proteinlerin her birinin arıtılmış lizatını aktarın ve GFP-füzyon proteinlerinin 2 saat boyunca bağlanmasına izin verin, 4 ° C'de ters çevirerek karıştırın. GFP-TrioD1 hücrelerinden lizatı buz üzerinde tutun.
- Yüklü GFP-Trap boncuklarını 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), 50 mM NaCl, %0.7 (a/h) Nonidet P-40'ta iki kez ve 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl2'de iki kez, yıkamalar arasında 2 dakika boyunca 2.700 x g'da çökeltme boncuklarını yıkayın.
- 40 μl 0.2 M glisin (pH 2.5) ekleyerek ve 30 saniye boyunca yukarı ve aşağı pipetleyerek GFP-füzyon proteinlerini elute edin. Hemen 60 saniye boyunca 21.000 x g'da tortu boncukları ve sıvıyı 4 μl 1 M Tris-HCl (pH 10.4) içeren yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın. Saflaştırılmış proteine verilen zararı sınırlamak için bunu hızlı bir şekilde yapın.
- Her saflaştırılmış proteinin 1 μl'sini Western blot ile analiz edin ve üreticinin protokolüne göre kantitatif bir lekeleme sistemi kullanarak nispi verim elde etmek için bir anti-GFP antikoru ile problayın. Alternatif olarak, bikinkoninik asit (BCA) tahlili ile protein konsantrasyonlarını belirleyin, ancak bu, proteinler tahlil ile aynı şekilde reaksiyona girmezse veya kirletici proteinler varsa hatalara neden olur.
- 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) ve 20 mMMgCl2 ilavesiyle molar protein konsantrasyonunu eşitleyin.
4. GTPase'nin nükleotid yüklemesi
- Adım 1'de hazırlanan GST-Rac1 manyetik boncukların bir parçasını çözün.
- 90 μl GST-Rac1 boncuk alın ve her adımda boncukları çökeltmek için manyetik bir parçacık sıralayıcı kullanarak 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCl, 0.1 mM DTT ve 4 mM EDTA ile üç kez yıkayın.
- Boncuklardan tampon aspire edin ve 100 μl 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 25 mM NaCl, 0.1 mM DTT ve 4 mM EDTA ekleyin.
- Yarışma deneyi için GSYİH, GTP veya nükleotid yüklemesi gerekip gerekmediğine göre, 60 μl GST-Rac1 boncuklarına 12 μl 100 mM GDP, 12 μl 10 mM guanozin 5'-[γ-tiyo]trifosfat (GTPγS) ekleyin veya nükleotid eklemeyin.
- Nükleotid yükleme kontrolleri için, kalan boncukları üç adet 10 μl'lik alikotlara bölün ve her tüpe 2 μl 100 mM GDP, 2 μl 10 mM GTPγS ekleyin veya nükleotit ekleyin.
- Boncuk karışımlarını 30 ° C'de 30 dakika çalkalama ile inkübe edin.
- Deneysel karışıma 1 MMgCl 2: 3 μl (adım 4.4) ve kontrol karışımlarının her birine 0.5 μl (adım 4.5) ekleyerek nükleotid bağlı Rac1'i stabilize edin.
5. Rekabet bağlama
- Her biri aşağıdakileri içeren 6 mikrofüj tüpü kurun:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl2
10 μl deneysel nükleotid yüklü Rac1 boncukları (adım 4.7'den itibaren)
5 μl Rac1 bağlayıcı protein A (sabit bağlayıcı protein)
- Her tüpe 0, 1, 2.5, 5, 10 veya 20 μl Rac1 bağlayıcı protein B (değişken bağlayıcı protein) ekleyin. Bu hacimler, sabit ve değişken bağlayıcı proteinlerin yaklaşık olarak eşit stok konsantrasyonlarını varsayar ve ayarlanması gerekebilir.
- İki proteinin bağlanma afinitelerinde büyük farklılıklar varsa, bağlayıcı proteinler A ve B'nin hacimlerini ayarlayın ve bu, deneysel tekrarlar yoluyla ampirik olarak belirlenmelidir. Bağlayıcı karışımın toplam hacmini 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) ve 20 mMMgCl2 ilavesiyle 235 μl'ye yükseltin.
- Aşağıdakileri içeren bir mikrofüj tüpü kurun:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl2
10 μl deneysel nükleotid yüklü Rac1 boncukları (adım 4.7'den itibaren)
10 μl Rac1 bağlayıcı protein A (sabit bağlayıcı protein)
- GDP, GTPγS ve nükleotid kontrol tüplerini ayarlayın:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM MgCl2
10 μl, GDP, GTPγS ile veya nükleotidsiz adım 4.5'te yüklenen ve adım 4.7.
'te stabilize edilen Rac1 boncuklarını kontrol edin
180 μl HEK293T GFP-TrioD1 lizat, adım 3.6
'deki gibi hazırlanır
4 μl 1 M MgCl2
- Karışımı 2 saat inkübe edin, 4 ° C'de ters çevirerek karıştırın.
- Boncukları 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) ve 20 mMMgCl2 ile üç kez yıkayın.
- 20 μl indirgeyici numune tamponunda (50 mM Tris-HCl (pH 7), %5 SDS, %20 gliserol, 0.02 mg/ml bromofenol mavisi, %5 β-merkaptoetanol) elute bağlı proteinler.