Viral Antijene Karşı Serumdaki Antikor İzotiplerini Tespit Etmek için Viral Antijen Mikroarray Testi

Özet

Kaynak: Khan, S., et al., Virüs Alt Tiplerinde Serum Antikorlarının Genişliğini Ölçmek için Bir İnfluenza Antijen Mikrodizisinin Kullanılması. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, influenza virüsü suşlarının antijenik alt tipleriyle basılmış bir mikrodizi slaytı kullanarak birden fazla insan serum örneğinde antikor izotiplerini tespit etme sürecini gösteriyoruz.

Protokol

1. İnfluenza antijen mikrodizileri üretin

1. Antijenleri mikrodizi slaytlarına yazdırın
   1. Her liyofilize antijeni% 0.001 Tween-20 (T-PBS) ile fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 0.1 mg / mL'lik bir konsantrasyona yeniden oluşturun. Sulandırılmış her bir antijenin 10 μL'sini, işlenmemiş 384 oyuklu düz tabanlı bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın.
   2. Antijeni numune kanalına aspire eden ve doğrudan temas ve kılcal hareket yoluyla 16 pedli nitroselüloz kaplı cam slaytlar üzerine bırakan düşük hacimli mikrodizi lekelenme pimlerine sahip bir mikrodizi yazıcı kullanarak antijenleri yazdırın.
      1. Yazdırma yazılımını (örn. Gridder) kaynak plakası yapılandırması ve yazdırma parametreleri ile programlayın.
         1. Bu yazdırma yöntemiyle kullanılacak kalıp tipinin adını seçmek için açılır menüyü kullanın. Bu çalışma için, işlenmemiş 384 oyuklu düz tabanlı bir plaka kullanın.
         2. Plaka Sayısı'nın yanındaki metin kutusunu seçin ve bu yazdırma protokolünde kullanılacak örnek kalıpların sayısını yazın. Bu çalışma için 1 plaka kullanın.
         3. Bu yöntemle kullanmak için bir pin yapılandırması seçin. Bu çalışma için 8 pinli bir konfigürasyon kullanın.
         4. Başlangıç ofsetlerinin, slayt başlangıç noktası (Yönetim bölümünde kalibre edilmiştir) ile yazdırma pimlerinin slaytlara yazdırmaya başlayacağı konum arasındaki mesafeler (X ve Y yönlerinde) olduğundan emin olun.
         5. Dizi Tasarımı sekmesini kullanarak, dizilerin boyutunu ve şeklini tanımlayın (nokta aralığı ve alt dizi başına nokta sayısı). Bu çalışma için, 8 pim kullanarak 18x18 formatında 16 pedli slaytlara 324 nokta (300 μm aralıklı 180 μm çap) yazdırın.
         6. Baskı pimlerinin numuneleri nasıl alıp dağıtacağına ilişkin parametreleri seçin. Bu çalışma için, her pin 250 nL antijen solüsyonu aspire eder ve 40 noktanın her birine 1 nL yazdırır (8 pinin tümü için toplam 20 slayt)
         7. Pin temizleme protokolünü ve lekeleme protokolünü yapılandırın. Bu çalışma için, her pin baskı antijeni, sonikasyonlu yıkama kabında steril ddH₂O'ya batırır ve daha sonra bir sonraki antijeni aspire eder.
         8. Örnek blokların slaytlara yazdırılma sırasını tanımlayın. Dizi yazılımı, her bir mikrodizi içindeki antijenlerin düzenini tanımlamak için açıklamalı bir ızgara indeksi (.gal) dosyası oluşturacaktır.
            not: Üst sıra, görüntüleme sırasında ızgaraları yönlendirmek için referanslar için (görüntülemede kullanılan tüm dalga boylarında floresan ile, örneğin, bu çalışmada Qdot 585 nm streptavidin konjugatı ve Qdot 800 nm streptavidin konjugatının bir karışımı) kullanılır. Uzun baskı çalışmaları için, kaynak plakasındaki antijenler, yukarı ve aşağı pipetleme ve ardından santrifüjleme yoluyla periyodik olarak yeniden askıya alınabilir veya yeni bir kaynak plakası hazırlanıp kullanılabilir.
   3. Problanmamış mikrodizi slaytları ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin ve uzun süreli saklama için oda sıcaklığında bir kurutucu kabinde saklayın.
      not: Protokol bu noktada süresiz olarak duraklatılabilir.
2. Kalite kontrol kontrolü yapın (poli-histidin etiketleri gerektirir)
   1. Sürgüyü problama odalarına takın ve adım 2.1.1-2.1.2'de açıklandığı ve Şekil 1'de gösterildiği gibi bir engelleme tamponu ile yeniden sulandırın.
   2. Fare monoklonal poli-His antikorunu filtrelenmiş 1x bloke edici tamponda 1:100 oranında seyreltin.
      not: Saflaştırılmamış protein antijenleri (örneğin, in vitro transkripsiyon ve translasyon sisteminde eksprese edilir) mikrodizileri yazdırmak için doğrudan kullanılırsa, protein ekspresyon sisteminin bileşenlerini ekleyin (ör., E. coli lizat) bu bileşenlere karşı yönlendirilmiş herhangi bir antikoru bloke etmek için serum seyreltmesi için kullanılan bloke edici tampon ile.
   3. Aspirasyondan sonra dizi pedini içeren her bir slayt odasına 100 μL seyreltilmiş poli-His antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de inkübe edin. Adım 2.2.1'de açıklandığı gibi 3x'i T-TBS tamponu ile yıkayın. Biyotin konjuge keçi anti-fare IgG ikincil antikoru 1:200'ü bloke edici tamponda seyreltin, aspirasyondan sonra kuyu başına 100 μL ekleyin ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. 3x'i T-TBS tamponu ile yıkayın.
   4. Qdot 585 nm streptavidin konjugatını bloke edici tamponda 4 nM'ye seyreltin, aspirasyondan sonra kuyu başına 100 μL ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. 3x'i T-TBS tamponu ile yıkayın ve ardından bir kez TBS tamponu ile yıkayın (Tween olmadan).
   5. Slaytları 2.2.5 – 3.1.2.
      adımlarında açıklandığı gibi parçalara ayırın ve niceliğini belirleyin not: Bu kalite kontrol protokolünü kullanmak için protein antijenlerinin His10 etiketlerini içermesi gerekir. Alternatif olarak, farklı bir etiket dahil edilirse, bu etiket için bir antikor veya ligand ile bir kalite kontrol kontrolü yapılabilir.

2. Mikrodiziler kullanarak influenza antikorları için serumları araştırın

1. Antikor bağlanması için serumları mikrodiziler üzerinde inkübe edin.
   1. Klipsleri kullanarak mikrodizi slaytları odalara takın ve Şekil 2. not: Mikrodizi pedine her zaman ellerinizle ve aletlerle dokunmaktan kaçının. Slaytların, ped tarafı yukarı bakacak ve küçük çentik sağ üst köşede olacak şekilde yönlendirildiğinden emin olun.
   2. Mikrodizi slaytlarını filtrelenmiş 1x bloke edici tamponun oyuğu başına 100 μL ile rehidrat edin ve serumu 100 μL bloke edici tamponda 1:100 seyreltin (işlenmemiş 96 oyuklu plakalar veya 2 mL tüpler kullanabilir). Her iki rehidre edilmiş mikrodizi slaytını kapalı çerçevelerde ve seyreltilmiş serumları oda sıcaklığında 30-250 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde ayrı ayrı inkübe edin. Sonraki tüm inkübasyon adımlarını çalkalayıcı üzerinde benzer şekilde gerçekleştirin.
      not: Sera, donma-çözülme döngülerini en aza indirmek için uzun süreli depolama için -80 °C'de ayrıştırılmalı ve dondurulmalı ve kullanımdan önce partikülleri gidermek için karıştırılmalı ve santrifüjlenmelidir. Sürgü odalarının yeniden monte edilmesini gerektiren herhangi bir sızıntıyı tespit etmek için bu adım sırasında ve sonrasında sürgü odalarını dikkatlice gözlemleyin.
   3. İkincil bir toplama şişesi ile bir vakum hattına bağlı pipet uçlarını kullanarak, pedlere dokunmadan engelleme tamponunu her bölmenin köşesinden dikkatlice aspire edin. Sonraki tüm aspirasyon adımlarını benzer şekilde gerçekleştirin. Pedlerin kurumasına izin vermemek için aspirasyondan hemen sonra pedlere seyreltilmiş serumlar ekleyin.
   4. Buharlaşmayı önlemek için kapalı çerçeveleri, nemli kağıt havlularla çevrili ve ağzı kapalı ikincil bir kabın içindeki tepsilere yerleştirin. Gece boyunca 4 °C'de sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin (alternatif olarak, 100-250 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilebilir).
2. Kuantum-nokta-konjuge ikincil antikorlar ile etiketli serum antikorları
   1. Serumları yukarıda tarif edildiği gibi odalardan dikkatlice aspire edin, T-TBS tamponunun oyuğu başına 100 μL ekleyin (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5'e ayarlanmış ve filtrelenmiş ddH_2O'da% 0.05 Tween-20, ticari olarak elde edilebilir) ve 100-250 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika inkübe edin. Bu yıkama adımını toplam 3 kez tekrarlayın (sonraki tüm yıkama adımları benzer şekilde gerçekleştirilir).
   2. Bloke edici tamponda 1 μM'ye seyreltilmiş ikincil antikorların bir karışımını hazırlayın ve homojenliği korumak için kullanımdan önce ve kullanım sırasında pipetleyerek iyice karıştırın.
      not: Tahlil tekrarlanabilirliğini korumak için, deneyler arasında verilerin kantitatif olarak karşılaştırılmasının planlandığı tüm sondalama deneyleri için her bir ikincil antikorun aynı partisi kullanılmalıdır. İkincil antikorun spesifik konsantrasyonunun, afiniteye bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir; Mümkün olduğunda üreticinin protokollerini izleyin.
   3. Son yıkamadan sonra odalardan tamponu aspire edin, ikincil antikor karışımının oyuğu başına 100 μL ekleyin ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
   4. Aspirat ikincil antikor karışımı 3x'i T-TBS tamponu ile yıkayın ve ardından TBS tamponu ile bir kez yıkayın (Tween olmadan).
   5. Pedlere dokunmaktan kaçınmak için mikrodizi slaytlarını odalardan dikkatlice ayırın, filtrelenmiş ddH₂O ile nazikçe durulayın ve 50 mL'lik tüplere yerleştirerek ve 500 x g'da 10 dakika santrifüjleyerek kurulayın.
   6. Problu mikrodizi slaytları ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin ve uzun süreli saklama için oda sıcaklığında bir kurutucu kabinde saklayın.
      not: Bu noktada protokol 1 haftaya kadar duraklatılabilir.

3. Mikrodizi içindeki antijenlere antikor bağlanmasını ölçün

1. Antikor bağlanmasını ölçmek için mikrodizi slaytlarını görselleştirin ve nokta floresan yoğunluğunu ölçün.
   1. Yerleşik yazılıma sahip taşınabilir görüntüleyiciyi kullanarak mikrodizi slaytlarının görüntülerini elde edin.
      1. Configure Imager (İmajı Yapılandır) sekmesinde, uygun slayt yapılandırmasını seçin. Bu çalışma için 16 pedli slaytlar kullanın.
      2. Görüntü Kontrolü sekmesinde, uygun floresan kanalını seçin ve en iyi görüntüleri elde etmek için serumun reaktivitesine bağlı olarak kazancı, pozlama süresini ve çekim süresini ayarlayın. Bu çalışma için, IgA ve IgG için floresan kanalları sırasıyla 585 nm ve 800 nm idi ve görüntüleme ayarları 50 kazanç, 500 ms maruz kalma süresi ve 1 s edinme süresi idi.
      3. Görüntüyü alma işlemini başlatmak için Yakala'ya tıklayın.
         not: Mikrodizi slaytları, karanlık ve kuru olarak saklandıkları sürece sinyallerde bozulma olmadan birden çok ayarda yeniden görüntülenebilir. Slaytlarla uyumlu olması durumunda diğer görüntüleme sistemleri de kullanılabilir.
2. Referans işaretleyicilere dayalı olarak yönlendirilmiş ızgaraları kullanarak dizi noktalarını tespit edin ve nokta yoğunluğunu, noktaların etrafında ölçülen piksel yoğunluğu eksi arka planın medyanı olarak ölçün. Bu niceleme algoritmasını, nokta yoğunluklarını her bir mikrodizideki tek tek antijenlere bağlamak için adım 1.1.2'de oluşturulan .gal dosyasını kullanan yerleşik görüntüleyici yazılımını kullanarak toplu olarak gerçekleştirin.
   1. Dosya Bilgileri panelinde, bilgisayardaki klasöründen seçim yaparak .gal dosyasını yükleyin ve Analiz Seçenekleri bölümünde analiz çıktı dosyalarının kaydedileceği klasörü belirtin.
   2. Görüntü Kontrolü sekmesinde, ölçülecek alınan görüntülerden birini açın ve sağ üst köşedeki Otomatik düğmesini seçin.
   3. Sağ alt köşedeki Dizi Analizi bölümünde, yazılım tarafından belirtildiği gibi bir referans şablonu oluşturun.
   4. Toplu Analiz'e tıklayın, ölçülecek görüntüleri içeren klasörü seçin ve önceki adımda oluşturulan referans şablonunu seçin. Yazılım her görüntüyü analiz eder ve nokta yoğunluğunu ölçer.
      not: Bu adım, daha sonra elektronik tablo manipülasyonu veya analiz yazılımında manipüle edilebilen mikrodizi üzerindeki her bir antijene bağlanan her bir serum örneği içindeki antikorları ölçen nokta yoğunluklarını içeren bir .csv dosyası oluşturacaktır.
3. Antijenler ve serum örnekleri arasında antikor bağlanmasını karşılaştırmak için ham verileri analiz edin. Bu çalışma için, 585 nm ve 800 nm floresan spot yoğunlukları olarak ölçülen IgA ve IgG antikorları, farklı günlerde farklı slaytlar kullanılarak deneyin 2 bağımsız çalışması arasında tüm antijenler arasında karşılaştırıldı ve test tekrarlanabilirliğini ölçmek için korelasyon analizi yapıldı.
   not: Ekspresyon karışımı olarak basılan saflaştırılmamış proteinler için, veri analizi, DNA kontrolü olmayan arka plan çıkarılması ile başlamalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1: İnfluenza antijen mikroarray baskı ve sondalama protokolünün şeması. Soldan sağa, mikrodizi, kuantum-nokta konjuge ikincil antikorlar kullanılarak IgG ve IgA antikorları için serumları araştırmak için kullanılan nitroselüloz kaplı slaytlar kullanılarak yazdırılır, slaytlar taşınabilir bir görüntüleyici kullanılarak görüntülenir ve sonuçlar bir ısı haritası oluşturmak için ana...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
16 pedli nitroselüloz kaplı cam kaydıraklar	Grace Biyo Laboratuvarları	305016
1x GVS HIZLI engelleme tamponu	Fischer Bilimsel	10485356
ArrayCam taşınabilir görüntüleyici	Grace Biyo Laboratuvarları	400S	Diğer görüntüleme cihazları, mikrodizi noktalarının çözünürlüğünü ve kuantum noktalarının uyarma ve emisyon dalga boylarını elde edebiliyorsa, slaytları görselleştirmek için kullanılabilir.
Biotin konjuge keçi anti-fare-IgG antikoru	Termo Fischer	31800
HiBase 384 kuyulu plaka	Greiner Bio-One	T-3037-11
Mikrodizi pimleri	ArrayIt	GMP2	Her farklı mikrodizi yazıcı, kendi özel mikrodizi pinlerine ihtiyaç duyabilir.
Fare monoklonal poli-His antikoru	Sigma-Aldrich	H1029
OmniGrid 100 mikrodizi yazıcı	GeneMachines		Bu çalışmada kullanılan mikrodizi yazıcının versiyonu artık ticari olarak mevcut değildir, ancak güncellenen benzer ekipman Digilab'ın (Hopkinton, MA) OmniGrid Accent mikrodizi yazıcısıdır ve aynı protokol ticari olarak mevcut mikrodizi yazıcıların çoğuyla gerçekleştirilebilir.
ProPlate kayar hazneler	Grace Biyo Laboratuvarları	246890
ProPlate kayar klipsler	Grace Biyo Laboratuvarları	204838
ProPlate kayar çerçeveler	Grace Biyo Laboratuvarları	246879
Kuantum nokta 585 nm konjuge keçi anti-insan-IgA antikoru	Grace Biyo Laboratuvarları	110620
Kuantum nokta 585 nm streptavidin konjugatı	Termo Fischer	Q10111MP
Quantum dot 800 nm konjuge keçi anti-insan-IgG antikoru	Grace Biyo Laboratuvarları	110610