İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Primer insan monositlerinin immünomanyetik negatif seleksiyon ile izolasyonu
- Dört adet 10 mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) vakum tüpünde (tüp başına 10 mL kan) 40 mL taze, insan tam kanı (bir HIV + hastasından veya sağlıklı kontrolden) toplayın. Bir biyogüvenlik kabini altında steril teknikler kullanarak, 40 mL kanın tamamını 50 mL'lik bir konik propilen tüpe aktarın.
- Seçilen insan monosit izolasyon kiti (Malzeme Tablosu) için üreticinin protokolünü takiben, kitte verilen 2 mL monosit izolasyon kokteylini kan tüpüne ekleyin. Kitte de bulunan manyetik boncukları 30 saniye boyunca vorteksleyin ve kan tüpüne 2 mL ekleyin.
- 40 mL'den az kan varsa, eklenen reaktifleri azaltın. Çözeltiyi karıştırmak için, 25 mL'lik plastik bir serolojik pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
- Kan karışımını dört adet 50 mL'lik tüpe eşit olarak ayırın ve her tüpe 1 mM EDTA içeren 30 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Plastik 25 mL serolojik pipet ile yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
- Antikor konjuge manyetik boncukları çıkarmak için tüpleri 10 dakika boyunca mıknatıs tutuculara yerleştirin. Her kan örneği için tutarlı inkübasyon ve izolasyon süreleri sağlamak için her tüp için bir tane olmak üzere aynı anda dört mıknatıs tutucu kullanın.
- İçeriği, hala mıknatıs tutucularındayken bir pipet kullanarak her tüpün ortasından çekin. Kırmızı kan hücrelerini çekmemeye dikkat edin (10 mL başlangıç hacminin en fazla %10'u) ve içeriği dört yeni 50 mL tüpten birine yerleştirin.
- Her 50 mL'lik tüpe 500 μL girdaplı manyetik boncuk ekleyin. 25 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyin ve RT'de 5 dakika inkübe edin. Ardından, tüpleri 5 dakika boyunca mıknatıs tutuculara yerleştirin.
- Hala mıknatıs tutuculardayken içeriği her tüpün merkezinden dört yeni 50 mL tüpten birine dikkatlice aktarın. Her yeni 50 mL'lik tüpü 5 dakika boyunca doğrudan mıknatıs tutuculara yerleştirin.
- İçeriği her tüpün merkezinden dört yeni 50 mL'lik tüpten birine dikkatlice aktarın. Tüm yeni 50 mL'lik tüpleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin ve dört hücre peletinin tümünü toplam 10 mL steril PBS'de yeniden süspanse edin.
- Bir hemositometre kullanarak tripan mavisi dışlaması ile hücreleri sayın.
NOT: 8-20 x 106 hücre genellikle 40 mL tam kandan elde edilir.
2. Birincil insan monositlerinin kültürlenmesi
- 37 °C'lik bir su banyosu kullanarak, %1 penisilin-streptomisin (kalem/strep) ile desteklenmiş ılık serumsuz RPMI 1640 besiyeri ve (biyogüvenlik kabini altında steril teknikler kullanmaya devam ederken) bu ortamdaki izole monositleri 1 x 106 hücre/mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
- 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna veya 35 mm'lik bir tabağa (son hücre sayısı 1 x 106 hücre / plaka olmalıdır) 1 mL yeniden süspanse hücre ekleyin ve% 5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin yapışması için 0,5-1,0 saat bekleyin.
- 37 ° C'lik bir su banyosu kullanarak, ılık ısıyla inaktive edilmiş (HI) fetal sığır serumu (FBS). Her plakaya 100 μL (% 10 nihai konsantrasyon) FBS ekleyin. Makrofaj farklılaşmasını teşvik etmek için hücrelere büyüme faktörleri ekleyin.
- Ortama 25 ng/mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ekleyerek M1 benzeri bir fenotip için makrofajları alayın. Ortama 50 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ekleyerek M2 benzeri bir fenotip için makrofajları alayın.
not: Hem GM-CSF hem de M-CSF, hücreleri sırasıyla M1 veya M2 için hazırlarken genel bir makrofaj fenotipine (M0) monosit farklılaşmasına izin verir.
