Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İntraperitoneal Lavaj ile PMC İzolasyonu ve Kültivasyonu
- İntraperitoneal lavaj ile PMC izolasyonu
- Hücre izolasyonundan önce, Tablo 1'de listelenen malzemeleri hazırlayın.
- PMC izolasyonu için 8 ila 14 haftalık erkek fareler kullanın. Bir fareyi CO2 soluyarak ötenazi yapın ve refleks kaybıyla ölümü doğrulayın. Fareye %70 etanol püskürtün ve pimleri kullanarak (sırt tarafı aşağı) bir köpük blok üzerine sabitleyin. Künt kenarlı makas kullanarak farenin ventral derisini çıkarın. Periton boşluğuna zarar vermekten kaçının.
not: Tipik olarak bu protokolü, C57BL / 6N suşu genetik geçmişine sahip fareler için kullanırız.
- 27 G iğne ile donatılmış 10 mL'lik bir şırınga kullanarak periton boşluğuna 7 mL buz gibi soğuk RPMI ortamı ve 5 ml hava enjekte edin. İğneyi peritonda dikkatlice itin ve herhangi bir organı delmeyin. Organ perforasyonu riskini azaltmak için epididimal yağ bölgesinde bir nokta kullanın.
- Enjeksiyondan sonra, periton hücrelerini RPMI ortamına ayırmak için fareyi 1 dakika sallayın. İç organlara zarar vermemek ve periton boşluğunu kanla kirletmemek için fareyi çok güçlü bir şekilde sallamayın.
- 10 mL'lik şırıngayı yeni bir 20 G kanül ile donatarak yeniden kullanın. Köpük bloğu eğerek ve diğer taraftan orta aspirasyonu kolaylaştırmak için tezgahın üzerine hafifçe vurarak iç organları bir tarafa kaydırın. 20 G'lik bir iğne yerleştirin, eğim verin ve iç organların tıkanmasını önlemek için sıvıyı karın bölgesinden nazikçe ve yavaşça (~ 0.5 mL / s) aspire edin. Mümkün olduğunca fazla sıvı toplayın (tipik olarak 5-6 mL).
- İğneyi şırıngadan çıkarın ve toplanan hücre süspansiyonunu buz üzerindeki bir toplama tüpüne aktarın. Görünür kan kontaminasyonu varsa bir numune tüpünü atın.
- Tüpleri hücre süspansiyonu ile ~ 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Steril bir başlık altında süpernatanı aspire edin. Her fare için, numune peletlerini 4 mL soğuk (4–10 °C) PMC Ortamında birleştirin ve hücre süspansiyonunu 25cm2'lik bir kültür şişesine aktarın. Büyüme faktörleri IL-3 ve SCF'yi sırasıyla 10 ng / mL ve 30 ng / mL'lik nihai konsantrasyonlara ekleyin. Hücreleri içeren şişeyi bir inkübatöre (37 °C ve% 5 CO2) yerleştirin ve bir sonraki prosedüre kadar ~ 48 saat inkübe edin.
- PMC kültürü
- 2. Gün (izolasyondan ~ 48 saat sonra): Orta değişim
- Süpernatan ve yapışık olmayan hücreleri (eritrositler ve ölü hücreler) çıkarmak için, şişenin kenarına bir Pasteur pipet ucu yerleştirerek ve şişeyi neredeyse yatay olarak tutarak ortamı şişeden aspire edin. Fare başına 4 mL önceden ısıtılmış PMC Medium ekleyin. Büyüme faktörleri IL-3 (10 ng/mL) ve SCF'yi (30 ng/mL) ekleyin. Hücreleri içeren şişeyi bir inkübatöre yerleştirin (37 °C ve% 5 CO2).
- 9. Gün: Hücre bölünmesi
- Hücre süspansiyonunu hücre kültürü şişesinden 50 mL'lik bir plastik santrifüj tüpüne aktarın. Şişeyi 10 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile üç kez yıkayın ve hücre süspansiyonunu aynı 50 mL plastik santrifüj tüpünde ayrılmış hücrelerle birlikte toplayın. Hücre konsantrasyonunu bir hemositometre ile sayın ve toplam hücre sayısını hesaplayın.
- Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca ~ 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. 1 x 106 hücre / mL hücre konsantrasyonunu elde etmek için peleti önceden ısıtılmış PMC Ortamında (37 ° C) geri kazanın. Hücre süspansiyonunu 25cm2'lik yeni bir kültür şişesine aktarın. Eski şişeyi dibe yapışan fibroblastlarla atın.
- Büyüme faktörleri IL-3 (10 ng/mL) ve SCF'yi (30 ng/mL) ekleyin ve hücreleri içeren şişeyi bir inkübatöre (37 °C ve %5 CO2) yerleştirin.
- 12-15. Günler: Hücre ölçümleri
- FcɛRI reseptörlerinin uyarılması ile ilgili herhangi bir deney planlanıyorsa, hücreleri standart bir kültür ortamında 300 ng / mL IgE anti-DNP ile gece boyunca ön işlemden geçirin.
2. PMC'lerde Beta-heksosaminidaz Salınım Ölçümü
- Ölçümlerden önce Tablo 2'de listelenen malzemeleri hazırlayın.
NOT: Stimülasyonlarından sonra MC'lerden salınan β-hekzosaminidaz, p-nitrofenil-asetil-D-glukozamini (pNAG) p-nitrofenol ve N-asetil-D-glukozamine hidrolize eder. Numunedeki β-heksosaminidaz miktarı, oluşacak p-nitrofenol miktarı ile orantılıdır. Yüksek pH'lı bir "Durdurma Çözeltisi" ortamında, p-nitrofenol tamamen protondan arındırılmış p-nitrofenolat olarak bulunur ve 405 nm'de ışık emilimi ile tespit edilebilir.
- 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5.6 mM glikoz ve BSA% 0.1 içeren Tyrode çözeltisini hazırlayın. 3 M NaOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın.
- Tyrode çözeltisine% 1 hacimde Triton X-100 ekleyerek lizis çözeltisini hazırlayın.
- 200 mM glisinden oluşan durdurma çözeltisini hazırlayın ve NaOH ile pH'ı 10.7'ye ayarlayın.
- pNAG çözeltisini (4-Nitrofenil 2-asetamido-2-deoksi-β-D-glukopiranozid) çözeltisini, pNAG'yi 0.4 M sitrik asit içinde 4 mM'lik bir nihai konsantrasyona çözerek hazırlayın.
- Tahlil için gereken hücre miktarını hesaplayın (tahlili iki nüsha halinde gerçekleştirin). Kuyu başına 200.000 PMC kullanın. Her genotip için negatif kontrol olarak 2 kuyucuk (DNP veya bileşik 48/80 gibi herhangi bir sekretagog içermeyen Tyrode çözeltisi) ve pozitif kontrol olarak 2 kuyucuk (10 μM İyonomisin içeren Tyrode çözeltisi) kullanın.
- Hücreleri 15 mL'lik bir plastik santrifüj tüpüne aktarın, Tyrode çözeltisi ile hacmi 15 mL'ye ayarlayın ve 4 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı bir Pasteur pipeti ile çıkarın ve Tyrode çözeltisindeki hücreleri 2 x 106 hücre / mL'ye yeniden süspanse edin.
- Kuyucuk başına 100 μL hücre süspansiyonunu 96 oyuklu bir V-tabanlı kuyu plakasına aktarın. Her bir oyuğa 25 μL stimülasyon veya kontrol solüsyonu ekleyin (Şekil 1A'da gösterilen pipetleme şemasına göre). Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 45 dakika inkübe edin.
- 96 oyuklu plakayı 5 dakika boyunca buzun üzerine koyarak reaksiyonu durdurun. Ardından, plakayı 4 °C'de 4 dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak 120 μL süpernatanı düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Hücre peletlerine dokunmaktan dikkatlice kaçının, ancak süpernatanı tamamen aspire edin.
- Hücre peletlerine 125 μL lizis tamponu ekleyin. Hücre peletlerini oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve inkübasyondan sonra tekrarlanan pipetleme (yaklaşık 5 kez) ile yeniden süspanse edin.
- 25 μL pNAG solüsyonunu (4 mM) yeni bir düz tabanlı 96 oyuklu plakanın gerekli kuyucuklarına pipetleyin. Hazırlanan pNAG çözeltisine her süpernatandan 25 μL ve ayrıca her hücre lizatından 25 μL ekleyin.
- Reaksiyon partilerini 37 °C'de 1 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, reaksiyonu durdurmak için her bir oyuğa 150 μL durdurma çözeltisi pipetleyin.
- Otomatik arka plan çıkarma için 630 nm referansıyla 405 nm'de çift dalga boyu ayarı kullanarak plakayı bir mikroplaka okuyucu ile analiz edin. Satın alma programında, "Referans" kutusunu işaretleyin ve "Absorbans" program öğesi menüsünde, açılır listeden "630 nm" yi seçin. Numunelerin optik yoğunluğu çok yüksekse, yeniden ölçmeden önce probun uygun bir seyreltmesini hazırlayın.
Tablo 1: Adım 1 için malzemeler.
| 1 | buz |
| 2 | 10 mL şırınga |
| 3 | 27 G iğneler |
| 4 | 20 gr iğne |
| 5 | Strafor blok ve pimler |
| 6 | Toplama tüpleri (50 mL Plastik Santrifüj Tüpleri) |
| 7 | % 70 etanol |
| 8 | RPMI Medium (Önceden soğutulmuş ve buz üzerinde tutulmuş) |
| 9 | PMC Ortamı: RPMI Orta +% 20 FCS (Fetal Buzağı Serumu) +% 1 Penisilin Streptomisin çözeltisi (Kalem-Strep) |
| 10 | Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin - DPBS (Ca2 + ve Mg2 + olmadan) |
| 11 | Kültür Mataraları (25 cm) |
| 12 | Büyüme faktörleri stok çözeltileri (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL) |
| 13 | Serolojik pipetler (10 mL) |
| 14 | Pipet uçları steril (20–200 μL) |
| 15 | Hemositometre |
| 16 | Tezgah Üstü Santrifüj |
| 17 | Makas ve forseps |
| 18 | Fareler için CO2 odası |
| 19 | Açık steril başlık |
| 20 | Kapalı steril başlık |
| 21 | Hücre inkübatörü (37 °C ve %5 CO2) |
| 22 | Transfer pipetleri (20–200 μL) |
Tablo 2: Adım 2 için Malzemeler.
| 1 | PMC (12-15 günlük) 1 x 106 hücre/mL |
| 2 | Anti-DNP-Antikor (IgE) stok çözeltisi |
| 3 | DNP-HSA stok çözümü |
| 4 | Bileşik 48/80 stok çözeltisi |
| 5 | İyonomisin |
| 6 | 96 oyuklu plaka, v şeklinde alt |
| 7 | 96 Kuyulu plakalar, düz tabanlı |
| 8 | Plastik santrifüj tüpleri (15 mL) |
| 9 | Serolojik pipetler |
| 10 | Hücre inkübatörü (37 °C ve %5 CO2) |
| 11 | Tezgah Üstü Santrifüj |
| 12 | Optik yoğunluk ölçümleri için mikrotitre plaka okuyucu |
| 13 | Çok kanallı pipet (20–200 μL) |
| 14 | Hemositometre |
