Fare Kupffer Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Kaynak: Bourgognon, M., et al. Nanopartikül Toksisite Testi için Kupffer Hücre İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, fare karaciğerinden Kupffer hücrelerinin veya karaciğer makrofajlarının izolasyonunu gösteriyoruz. Karaciğer bir sindirim çözeltisi ile perfüze edilir, ardından yoğunluk gradyan ayrımı yapılır. İzole edilmiş yapışık Kupffer hücreleri daha ileri analizler için kullanılabilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Perfüzyon ve Hücre Toplanması (Şekil 1)

1. Malzeme tablosunda açıklanan tüm reaktifleri taze olarak hazırlayın.
2. EGTA (Etilen Glikol Tetra-asetik Asit) / HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi) Çözeltisini (fare başına 50 ml) ve Kollajenaz Çözeltisini (fare başına 100 ml) 40 ° C'de 30 dakika ısıtın.
3. Pompa esnek borusunu önce %70 etanol ile durulayın. 40 ml EGTA/HBSS Solüsyonunu su banyosuna batırılmış bir santrifüj tüpüne dökün ve pompa esnek hortumunu önceden ısıtılmış EGTA/HBSS Solüsyonu ile durulayın.
4. Solunum depresyonu ve ölümden önce güvenilir bir şekilde bilinç kaybı oluşturmak için bir barbitürat kullanarak terminal anestezi uygulayın. Fenobarbitonu 1 mg / kg, i.p. dişi veya erkek CD1 faresine (35-45 g) enjekte edin. Anesteziyi ayak parmağınızı sıkıştırarak onaylayın.
5. Karın kıllarını tıraş edin ve% 70 etanol çözeltisi kullanarak karın yüzeyini sterilize edin.
6. Karın boşluğunu kesin ve bağırsağı karnın soluna lateral olarak hareket ettirerek portal ven ve inferior vena kava'yı ortaya çıkarın.
7. Pompayı EGTA/HBSS Solüsyonu ile 1-3 ml/dk hızında başlatın ve 23 g kelebek iğne (kanat kesimi) kullanarak portal veni kanüle edin. Portal venin 23 G iğne ile kanüle edilmiş bölümünü kelepçeleyin ve ardından açılan fare karnının yüzeyindeki serrefine forsepsleri çevirin. Karaciğer, EGTA / HBSS Solüsyonu perfüzyonunun ilk 30 saniyesi içinde hızla soluklaşmalıdır.
8. Karaciğerde aşırı basınç oluşmasını önlemek için inferior vena kavanın alt kısmını hızla kesin ve ardından perfüzyonun ilk dakikasında akış hızını kademeli olarak 7 ml / dk'ya yükseltin. Hayvan, vena kaval venipunktürüne sekonder kanama nedeniyle ölür.
9. Santrifüj tüpünde 5 ml'den az EGTA / HBSS Çözeltisi kaldığında, Kollajenaz Çözeltisi (40-50 ml) ile doldurun. Akış hızını 30 saniyenin üzerinde kademeli olarak 10 ml/dk'ya yükseltin.
10. 5-10 saniye aralıklarla cımbız kullanarak inferior vena kavaya baskı uygulayarak karaciğerin şişmesini sağlayın. Bu periyodik olarak yapılabilir (sindirim sırasında 5-10 kez). Bu adım, karaciğer hücresi ayrışmasını iyileştirecek ve kollajenaz ile perfüzyon süresini azaltacaktır.
11. Santrifüj tüpü içinde 10 ml'den az Kollajenaz çözeltisi kaldığında, 40-50 ml önceden ısıtılmış Kollajenaz çözeltisini santrifüj tüpüne dökün.
12. 10-15 dakika perfüzyon ve yaklaşık 70-80 ml Kollajenaz Çözeltisi perfüze edildikten sonra, karaciğer yüzeyine bir forseps ile küçük bir basınç uygulayın. Basıncın bir baskısı, karaciğer hücrelerinin ayrıştığını gösterir.
13. Karaciğeri karın boşluğundan tek parça halinde çıkarın ve 20-30 ml Kupffer Hücreleri İzolasyon Ortamı içeren bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Karaciğer hücresi canlılığını etkilememek için karaciğer hücrelerini buz üzerinde veya en fazla 3 saat boyunca 4 ° C'de tutun.
14. Gerekirse, perfüze karaciğeri buz üzerinde tutarken perfüzyon prosedürünü birkaç hayvan üzerinde tekrarlayın. Saflaştırma için bir ila üç karaciğeri bir araya getirin ve 3. aşamaya geçin.

2. Santrifüjleme için Yoğunluk Gradyanının Hazırlanması (Şekil 2)

1. Steril koşullar altında aşağıdaki adımlarla (bölüm 2, 3 ve 5) devam edin ve hücreleri buz üzerinde veya 4 ° C'de tutun. 15.3 ml kaplanmış silika partikül solüsyonunu 1.7 ml 10 x PBS ile karıştırarak SIP'yi (İzotonik kaplı silika Parçacıkları Çözeltisi) hazırlayın.
2. 20 ml% 25'lik SIP çözeltisi yapmak için 5 ml SIP'yi 15 ml PBS ile karıştırın. 20 ml% 50 SIP çözeltisi yapmak için 10 ml SIP'yi 10 ml PBS ile karıştırın.
3. Bir santrifüj tüpünü 20 ml% 50 SIP çözeltisi ile doldurun. Santrifüj tüpünü 90°'ye yakın bir açıyla eğin ve %25 SIP solüsyonunu (20 ml) %50 SIP tabakasının yüzeyine dokunmadan 25 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak tüpün yan duvarına yavaşça ekleyin. %25 SIP solüsyonunu eklerken, tüpün açısını kademeli olarak azaltın. Kullanana kadar yoğunluk gradyanını buz üzerinde tutun.

3. Kupffer Hücre Saflaştırması (Şekil 3)

1. Bir perfüze karaciğeri 15 ml Kupffer Hücre İzolasyon Ortamı içeren bir Petri kabına koyun. Makas kullanarak Glisson kapsülünü (karaciğer zarı) yırtın ve tüm karaciğer hücrelerini Kupffer hücre izolasyon ortamına bırakın. Çözeltiyi bir santrifüj tüpünde toplanacak 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. Perfüzyon prosedürünü ek perfüze karaciğerler üzerinde tekrarlayın ve hücreleri aynı santrifüj tüpünde toplayın (bir fareden 15 ml ve üç fareden 45 ml'ye kadar).
2. Hücre süspansiyonunu 50 ° C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Parankimal hücreler (hepatositler) pelette olacak ve parankimal olmayan hücreler (Kupffer hücreleri dahil) süpernatantta olacaktır.
3. Süpernatanı temiz bir santrifüj tüpünde toplayın ve her biri 2 dakika boyunca 50 x g'da santrifüjleyin. Bu adımı üç kez daha tekrarlayın.
4. Parankimal olmayan hücreleri peletlemek için 15 dakika boyunca 1.350 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 10 ml Kupffer Hücre İzolasyon Ortamında yeniden süspanse edin.
5. Parankimal olmayan hücre çözeltisini, 2.3'te tarif edildiği gibi% 25/50 süreksiz izotonik gradyan üzerine ekleyin. Hızlanma veya kırılma olmadan 15 dakika boyunca 850 x g'da santrifüjleyin.
6. %25 SIP fraksiyonu içinde bulanık görünen zenginleştirilmiş Kupffer hücre fraksiyonunu, %25/50 SIP arayüzüne yakın lokalize edin (Şekil 3). 10 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak, zenginleştirilmiş Kupffer hücre fraksiyonunun yaklaşık 12 ml'sini aspire edin. Hücreleri 35-40 ml Kupffer Hücre İzolasyon Ortamı içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Nazikçe karıştırın ve pelet hücrelerine 1.350 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
7. Süpernatanı atın ve hücreleri 5-10 ml önceden ısıtılmış Kupffer Hücre Kültürü Ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın (hemositometre) ve tripan mavisi boyama kullanarak canlılığı ölçün.
8. Saflaştırılmış parankimal olmayan hücreleri, 5 x 10⁵ hücre / kuyucuk yoğunluğunda 24 oyuklu plakalarda plakalayın. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de inkübe edin (Şekil 3). 30 dakika sonra, ortamı nazikçe çıkarın, önceden ısıtılmış Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile bir kez yıkayın ve ardından 500 μl taze ve önceden ısıtılmış Kupffer Hücre Kültürü Ortamı (oyuk başına) ile değiştirin.

Sonuçlar

Şekil 1: Karaciğer perfüzyonu. Farenin anestezisinden sonra, portal veni (PV) erişilebilir kılmak için sindirim sistemi yanal olarak karnın soluna doğru hareket ettirilir. PV, yavaş bir akış hızı (1-3 ml / dak) EGTA / HBSS Çözeltisi kullanılarak kanüle edilir ve karaciğer içinde herhangi bir aşırı basıncı önlemek için inferior vena kava (IVC) hemen yırtılır. Perfüzyonun ilk dakikasında akış hızı kadem...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Öthatal (pentobarbital sodyum)	Merial
CD1 fareler	Charles Nehri	-	Fare ağırlığı 35 ila 45 g arasında değişmelidir. Ağırlıkları hızla arttığı için erkek CD1 farelerinin kullanılmasını tavsiye ederiz (örneğin, 7 haftalık bir erkek CD1 faresinin ağırlığı 35 g'ı aşar). Ayrıca, yaşlı hayvanların teslimatını ayarlamak için hayvan tedarikçisiyle önceden iletişime geçmeniz tavsiye edilir. Alternatif olarak, hayvanlar istenen ağırlığa ulaşmak için evde olabilir.
HBSS (Ca2+ ve Mg2+ içermez, bikarbonatlı)	Yaşam Teknolojileri	14175-053	HBSS, Ca2+ içermemelidir.
Etilen Glikol Tetraasetik Asit (EGTA) tetrasodyum tuzu	Sigma-Aldrich	E8145	EDTA da kullanılabilir, ancak EGTA, Ca2 + 'yı seçici olarak şelatlama avantajına sahiptir.
HEPES (1M)	Yaşam Teknolojileri	15630-056	100 ml
Kollajenaz tip-IV	Worthington	CSL-4	Farklı kollajenaz partilerinin test edilmesi veya en azından tedarikçiye ürünün karaciğer hücresi izolasyonu için uygun olması gerektiğinin belirtilmesi tavsiye edilir
Düşük glikoz DMEM	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI (sodyum piruvat ve Glutamax® ile)	Yaşam Teknolojileri	12633-012	500 ml
Penisilin / Steptomisin	Yaşam Teknolojileri	15140-122	100 ml
Fetal Sığır Serumu	İlk bağlantı	60-00-850	500 ml
Tripan mavisi çözeltisi	Sigma-Aldrich	T8154	100 ml
Kaplamalı silika partikül çözeltisi (Percoll®)	GE Sağlık Hizmetleri	17-0891-02	Percoll® çok kararlıdır ve birkaç yıl saklanabilir
1x Fosfat Tamponlu Salin	Yaşam Teknolojileri	10010-023	500 ml
10x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su	Yaşam Teknolojileri	70011-036	500 ml
Kelebek kan alma seti (23G/305mm uzunluğunda tüp)	Bd	367288
Şırınga Filtreleri (0.22 μm Mavi Jantlı)	Minisart	16534-K
Santrifüj Tüpleri (50 ml Mavi Kapaklı)	BD Biyolojik Bilimler, Falcon	35 2070
Petri kabı (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Bilimsel	BSN 101VR20
100 μm hücre süzgeci	Bd	352360
Peristaltik pompa	Watson Marlow'un	Bilim 300	Her kullanımdan önce ve sonra hortumu steril PBS ve% 70 etanol ile durulayın.
24 oyuklu plakalar	Corning	3526
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5810R
Tırtıklı ince forseps	Hammacher GmbH	Ürün No. HSE 004-35 / Kat. No. 221-0051	Serrefin forsepsler, perfüzyon prosedürü sırasında forsepsleri tutmaya gerek kalmadan 23G iğnesi ile kanüle edilmiş damarın klemplenmesine izin verir. Erişim Adresi: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Hücre kazıyıcı	BD Biyolojik Bilimler, Falcon	353086	24 oyuklu plakalardaki hücreleri kazımak için bıçak ekstremitelerini bir makasla kesin.
EGTA (Etilen Glikol Tetraasetik Asit)/HBSS (Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi) Çözeltisi			0.5 mM EGTA ve 25 mM HEPES içeren HBSS. PH'ı 7.4'e ayarlayın. Her karaciğerin perfüze olması için 50 ml hazırlayın.
Kollajenaz Çözeltisi			100 UI/ml, 15 mM HEPES ve %1 Penisllin/Streptamisin'de (h/h) kollajenaz tip IV içeren DMEM düşük glikoz. PH'ı 7.4'e ayarlayın. Her karaciğerin perfüze olması için 100 ml hazırlayın. Kollajenaz eklendikten sonra, kullanmadan önce çözeltinin 30 dakika ısıtılması tavsiye edilir. Bu, kollajenaz aktivitesinin optimum olmasını sağlar.
Kupffer Hücre İzolasyon Ortamı			RPMI içeren, %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler (h/h),%1 glutamax® (h/h) ve %1 Peniklin / Streptomisin (h/h). 1-3 karaciğer için en az 100 ml hazırlayın.
Kupffer Hücre Kültürü Ortamı			%10 Fetal Sığır Serumu, %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler (h/h),%1 Glutamax® (h/v) ve %1 Peniklin / Streptamisin (h/h) içeren RPMI. 1-3 karaciğer için en az 100 ml hazırlayın.
SIP (izotonik kaplı silika parçacıklarının çözeltisi)			17 mL SIP elde etmek için 1.7 ml 10x Fosfat Tamponlu Salin ile 15.3 ml Percoll® karıştırın.
%25 SIP çözümü			5 ml SIP'yi 15 ml 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su ile karıştırın
%50 SIP çözümü			10 ml SIP'yi 10 ml 1x Fosfat Tamponlu Salin ile karıştırın
Lizis Tamponu			%0.9 Triton X-100 içeren DMEM ortamı
PBS/BSA Çözümü			% 1 Sığır Serum Albümini ile taze Fosfat Tamponlu Salin pH 7.4 hazırlayın.

Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi fotoğrafı. Serisi