Yöntem makalesi

Mycoplasma optimize edilmiş PCR tabanlı Algılama

DOI:

10.3791/3057

⸱

20 Haziran 2011

 , 
1Product Management, Sigma-Aldrich

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit, hücre kültürleri ve biyolojik elde edilen diğer hücre kültürü, Acholeplasma Mycoplasma ve Ureaplasma kontaminasyon algılama en yüksek hassasiyet için tercih edilen yöntem olarak kurulmuş olan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), kullanır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kirlilik içermeyen hücre hatlarının bakım, hücre tabanlı araştırma esastır. Mycoplasma kirlenme kirletici en büyük endişeleri arasında. Genellikle kirlenmiş hücreleri mycoplasma öldürmez rağmen, tespit edilmesi zor olan ve değişen metabolizma dahil olmak üzere, kültür hücreleri üzerindeki etkileri çok çeşitli yol açabilir, proliferasyon ve kromozomal anormallikler yavaşladı. Kısacası, mycoplasma kirlenme, yaşam bilimleri araştırma için doğru veri sağlayan bu hücre hatları değer uzlaşır.

Laboratuvarda mycoplasma kirlenme kaynakları tamamen kontrol etmek için çok zorlu. Belirli mycoplasma türünün insan cildi üzerinde bulunan gelince, onlar zayıf aseptik tekniği ile tanıtılacak. Ayrıca, fetal sığır serumu gibi kirlenmiş takviyeleri gelebilir ve en önemlisi diğer kontamine olmuş hücre kültürleri. Mycoplasma bir kültür kirletiyorsa, laboratuar diğer alanlarda hızlı bir şekilde kontamine yayılabilir. Böyle iyi aseptik teknik olarak iyi laboratuvar uygulamaları ile sıkı sıkıya bağlı kalmanın anahtarıdır, mycoplasma için rutin test ve son derece başarılı mycoplasma kirlenme kontrolü için tavsiye edilir.

Mycoplasma PCR-tabanlı algılama rutin hücre hattı bakım için çok popüler bir yöntem haline gelmiştir. PCR-tabanlı algılama yöntemleri son derece hassas ve hızlı sonuç, araştırmacılar, mikrobiyolojik yöntemler kullanılarak gerekli zamana kıyasla kirlenme tespit kez izole etmek ve ortadan kaldırmak için hızlı bir şekilde yanıt verir sağlayabilir. LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit ul başına sadece 2 genomların bir algılama sınırı ile, son derece hassas. Son derece özel HızlıBaşlangıç ​​Taq DNA Polimeraz ve özel bir astar tasarımı yararlanan, yanlış pozitif büyük ölçüde azalır. 8-tüp uygun biçim, dNTP ile kaplı öncesi ve ilişkili primerleri şeritler hücre hatlarının büyük koleksiyonları ile müşterilerinin ihtiyaçlarını karşılamak için işlem hacmi artmasına yardımcı olur.

Kiti aşırı hassasiyeti göz önüne alındığında, büyük bir özenle, numune ve reaktiflerin yanlışlıkla kirlenmeyi önlemek için gerekli önlemler alınmalıdır. Gösteren adım adım protokolü güvenilir mycoplasma tespiti için gerekli önlemleri ve uygulamaları vurgulamaktadır. Biz de göstermek ve tipik sonuçları ve bunların yorumlanması tartışmak. Amacımız, araştırmacıların LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit kullanarak başarı sağlamaktır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mycoplasma Algılama

  1. Hücre kültürü süpernatantlar doğrudan test edilebilir veya örnek daha sonraki bir tarihte kullanılmak için hazırlanmıştır. Daha sonra hazırlanmak için 95 yerine 100 ul süpernatant, steril bir amplifikasyon tüp ve inkübe ° C 5 dakika. Bir kez bu örnek bir haftaya kadar 2-8 ° C'de saklanabilir tamamlandı. Sadece öncesinde pelet için örnek kısaca santrifüj (5 saniye) herhangi bir hücresel enkaz çalıştıran.
  2. PCR örnekleri hazırlamak için, tepkimeler için gerekli Hızlıbaşlangıç ​​Taq DNA polimeraz / rehidrasyon tampon toplam hacmi belirlemek. Biz 5 toplam reaksiyon hazırlanıyor. Beş reaksiyonlar Taq 2.5μl ve rehidrasyon tampon 114.5μl gerekecektir. Bu örnek reaksiyon ve negatif kontrol, pozitif kontrol için artı rehidrasyon tampon 24.5μl başına rehidrasyon tampon reaksiyon ve 22.5μl başına Taq en az bir birim içerecektir. DNA polimeraz reaksiyon ortalama 1 birim rehidrasyon tamponu uygun bir hacmi ilave edilmelidir. Bu kullanılan Taq değişecektir.
  3. Taq DNA polimeraz hesaplanan hacim, temiz bir mikrosantrifüj tüpe koyun ve rehidrasyon tampon hesaplanan hacim ile takip. DNA polimeraz / rehidrasyon tampon tüp Flicking hafifçe karıştırılmalıdır. Bu karışım vortekslenmiş olmamalıdır.
  4. Negatif kontrol hazırlamak için ve örnekler kit sağlanan şeffaf reaksiyon tüpleri kullanırlar. Kiti verilen reaksiyon tüpleri zaten nuclueotides, astar ve iç kontrol DNA içerir. Önceki adımları hazırlanan Hızlıbaşlangıç ​​Taq DNA Polimeraz / Su kaybını giderme tampon karışımı, 23 ul negatif kontrol ve örnek tüpleri her konulmalıdır. Negatif kontrol 2 ul DNA serbest su ekleyin ve numune tüpleri ve etiket her biri için 2 örnek ul ekleyin. Tüpler hafifçe vurarak içindekileri karıştırın. İçeriği vortekslenmiş olmamalıdır.
  5. Pozitif kontrol hazırlamak için kit içinde sağlanan pembe reaksiyon tüpleri kullanın. Kiti verilen reaksiyon tüpleri zaten nuclueotides, astar ve iç kontrol DNA içerir. Önceki adımlarda hazırlanan Hızlıbaşlangıç ​​Taq DNA polimeraz / Su kaybını giderme tampon karışımı 25 ul, reaksiyon tüpleri ve etiket ekleyin. Tüpler hafifçe vurarak içindekileri karıştırın. İçeriği vortekslenmiş olmamalıdır. Negatif kontrol, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında pozitif kontrol ve örnek tüpleri inkübe edin.
  6. PCR olabilmesi için örneklerin bir termal cycler yerleştirilmesi gerekir. HızlıBaşlangıç ​​Taq kullanırken bir etkinleştirme adım gerekli değildir. Termal cycler reaksiyon tüpleri yerleştirin. Döngüleri şu şekilde olmalıdır: 94 ° C, 30 saniye boyunca 55 ° C de 30 saniye ve 40 saniye boyunca 72 ° C için. Bu döngüleri 40 kez çalıştırmak olacaktır.
  7. Örnekleri PCR döngüleri tamamladıktan sonra termal cycler çıkardıktan ve buz yerleştirerek 4-8 ​​° C soğutulması gerekmektedir. Örnekleri soğutmalı agaroz jel elektroforezi için üzerine yüklenmiş olması gerekir. Onlar zaten reaksiyon tüpleri mevcut olduğu gibi, yükleme jel ve boya gerekli değildir. Doğrudan ayrı bir şeride her PCR için 8 ul yükleyin. 3.0 cm - 2.5 geçişten sonra elektroforez durdurun.

2. Temsilcisi Sonuçlar

Negatif kontrol grubu yaklaşık 481 bp göstermelidir. Bu videonun başında gösterilen elektroforez jel üzerinde negatif kontrol sütununda görülebilir. 481 bp negatif kontrol grubu polimeraz aktivitesi sufficienttaq yeterince duyarlı olmadığını yokluğunda iyi bir gösterge.

270 aralığında bantlar ± 8 bp Mycoplasma pozitif örnekler gösterecektir. Grubun yüksek derecede kontamine numuneler için ağır ve hafif kontamine olmuş örnekler için soluk olacaktır. Yoğunluğundaki değişimler videonun başında gösterilen elektroforez jel üzerinde olumlu bir örnek sütunları görülebilir. Tüm numuneler, PCR beklendiği gibi meydana geldiğini göstermek için bir iç negatif kontrol içerir. Yüksek derecede kontamine numuneler üzerinde iç kontrol yokluğu görmek için normaldir.

Olumlu olumsuz örnek yelpazesi aralığı veya bir grup bir grup yoksa bu örnekleri inhibe olduğunu iyi bir gösterge. PCR inhibitörlerinin örnek inhibe ise DNA ekstraksiyonu yaparak çıkarılabilir.

figure-protocol-1
Şekil 1 İlgili Amplikon bantları: PCR ile mycoplasma tespit sonuçları gösterilmiştir. Lane 2 negatif kontrol, yaklaşık 481 bp bir grup göstermesi gerekir. 481 bp negatif kontrol grubu Taq kullanılan yeterince hassas olmadığını yokluğunda iyi bir gösterge. Mycoplasma-pozitif örnekler 270 aralığında bantları gösterecektir + şerit 3 gösterildiği gibi 8 bp - 6. Grubun hea olacakVy yüksek derecede kontamine numuneler (şerit 6) ve hafifçe kontamine numuneler (şerit 4) soluk. Tüm örnekler PCR beklendiği gibi meydana geldiğini göstermek için dahili bir negatif kontrol (481 bp) içerir. Yüksek derecede kontamine numuneler üzerinde iç kontrol yokluğu görmek için normaldir.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kiti aşırı duyarlılık nedeniyle, doğru yapıldığında kiti örnek mycoplasma kirlenme olup olmadığını gösteren kesin sonuçlar vermesi gerekir. Kiti HızlıBaşlangıç ​​Taq DNA Polimeraz ile kullanım için optimize edilmiştir. Diğer taqs numuneler hazırlanırken kullanılan olabilir, ancak 481 bp iç kontrol grubu alternatif Taq uygun hassasiyet göstermek için mevcut olmalıdır. Olumlu bantlar kontaminasyon düzeyine bağlı olarak, çeşitli yoğunluklar sergilemek mümkündür. Ağır kontamine numuneler iç kontrol grubu olmaması gözlemlemek mümkündür. ,, Kirlenmeyi önlemek için numunelerin hazırlanması dikkatli ve doğru teknik kullanarak uygun için çok önemlidir. LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit kullanarak algılama.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu makalede kullanılan reaktifler ve araçlar üretilen Sigma-Aldrich çalışanları.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sigma-Aldrich tarafından finanse edilen

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifin Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
LookOut Mycoplasma PCR Algılama Takımı Sigma-Aldrich MP0035
HızlıBaşlangıç ​​Taq DNA Polimeraz Sigma-Aldrich D9307
GenElute Kan Genomik DNA kiti Sigma-Aldrich MP0030
Nunc amplifikasyon tüpleri Sigma-Aldrich T0447

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
  2. Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
  3. Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. , (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mycoplasma TespitiPCR TespitiLookOut KitiDNA PolimerazJel ElektroforeziAseptik TeknikKontaminasyon KontrolH cre Hatt TestiKontrolTermal D ng leme

İlgili makaleler