İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Makrofajlara Farklılaşması

Özet

Kaynak: Lopez-Yrigoyen, M., et al. Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Makrofajlarının Üretimi ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu videoda, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) makrofajlar üretmek için in vitro bir yöntem açıklanmaktadır. iPSC'lerden makrofaj üretimi üç aşamada gerçekleşir: (i) mezodermal hücrelere farklılaşan üç boyutlu embriyoid cisimcikleri (EB'ler) oluşturmak için iPSC'lerin süspansiyon halinde toplanması, (ii) farklılaşmış EB'lerden makrofaj öncü hücrelerinin oluşumu ve (iii) makrofaj öncü hücrelerinin olgun, fonksiyonel makrofajlara farklılaşması.

Protokol

1. İnsan iPSC'sinin Makrofajlara Farklılaşması

>NOT: Makrofaj farklılaşma protokolünün şematik bir özeti Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Hücre farklılaşması, büyüme faktörleri ve diğer reaktiflerin hazırlanması
   1. İnsan embriyonik kök hücre serumsuz besiyeri hazırlayın (hESC-SFM; Malzeme Tablosuna bakınız) Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle medium-F12'sini (DMEM / F12) hESC takviyesi,% 1.8 w / v sığır serum albümini (BSA) ve 0.1 mM 2-merkaptoetanol ile destekleyerek.
   2. Jelatini steril suda çözerek ağırlıkça %0.1 domuz jelatini çözeltisi hazırlayın. Jelatin çözeltisi 4 °C'de 2 yıla kadar saklanabilir.
   3. BMP4'ü 4 mM hidrojen klorür (HCl) -% 0.2 BSA PBS çözeltisine çözerek insan kemiği morfogenetik proteini (BMP4) stok çözeltisini (25 μg / mL) hazırlayın. Stok çözeltisini kriyotüplerde 50 μL'lik alikotlar olarak dağıtın. Stok çözeltileri -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Çözüldükten sonra, stok BMP4 5 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
   4. VEGF'yi %0.2'lik bir BSA PBS çözeltisine çözerek insan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) stok çözeltisini (100 μg/mL) hazırlayın. Stok çözeltisini kriyotüplerde 10 μL'lik alikotlar olarak dağıtın. Stok çözeltileri -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Stok VEGF çözüldükten sonra 4 °C'de 7 gün saklanabilir.
   5. SCF'yi %0.2'lik bir BSA PBS çözeltisine çözerek insan kök hücre faktörü (SCF) stok çözeltisini (100 μg/mL) hazırlayın. Stok çözeltisini kriyotüplerde 5 μL'lik alikotlar olarak dağıtın. Stok çözeltileri -20 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Çözüldükten sonra, stok SCF 10 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
   6. IL3'ü %0.2'lik bir BSA PBS çözeltisine çözerek insan interlökin-3 (IL3) stok çözeltisini (10 μg/mL) hazırlayın. Stok çözeltisini kriyotüplerde 500 μL'lik alikotlar olarak dağıtın. Stok çözeltileri -20 °C'de 2 yıla kadar saklanabilir. Çözüldükten sonra, stok IL3 15 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
   7. CSF1'i %0.2'lik bir BSA PBS çözeltisine çözerek insan makrofaj koloni uyarıcı faktör (CSF1) stok çözeltisini (10 μg/mL) hazırlayın. Stok çözeltisini kriyotüplerde 1 mL alikot olarak dağıtın. Stok çözeltileri -20 °C'de 2 yıla kadar saklanabilir. Çözüldükten sonra, stok CSF1 15 gün boyunca 4 °C'de saklanabilir.
2. Aşama 1: Embriyoid cisimciklerinin oluşumu (0. gün – 3. gün)
   1. 0. günde, 2.25 mL Aşama 1 ortamı (50 ng / mL BMP4, 50 ng / mL VEGF ve 20 ng / mL SCF ile desteklenmiş hESC-SFM) ultra düşük bağlantılı 6 oyuklu plakaların iki oyuğuna ekleyin.
   2. 6 oyuklu bir plakada %80 birleşik iPSC kuyusunun bakım ortamını 1,5 mL Aşama 1 ortamıyla değiştirin.
   3. Hücre pasaj aracını kullanarak kolonileri kesin ve kesilen kolonileri bir pipetle ultra düşük bağlantılı 6 oyuklu bir plakanın iki kuyusuna aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
   4. 2. günde, 0.5 mL hESC-SFM ortamı kullanarak sitokinleri 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF ve 20 ng/mL SCF nihai konsantrasyonuna getirin.
      not: IPSC kolonileri EB'ler haline gelecektir (Şekil 2A).
3. Evre 2: Süspansiyonda hematopoetik hücrelerin ortaya çıkışı
   1. 4. günde, 6 oyuklu bir doku kültürü plakasının 4 kuyusunu% 0.1 w / v jelatin ile kaplayın ve en az 10 dakika inkübe edin.
   2. Jelatini çıkarın ve 2,5 mL Aşama 2 ortamı ekleyin (100 ng/mL CSF1, 25 ng/mL IL-3, 2 mM glutamaks, %1 penisilin-streptomisin ve 0,055 mM 2-merkaptoetanol ile desteklenmiş X-VIVO15).
   3. Oluşan EB'leri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmelerine izin verin. Medyayı dikkatlice aspire edin.
   4. EB'leri 2 mL Aşama 2 ortamında yeniden askıya alın.
   5. 10-15 EB'yi (en fazla 15) 2,5 mL Aşama 2 ortamı içeren jelatin kaplı bir kuyucuğa aktarın.
   6. EB'leri 37 °C'de ve %5 CO₂ havasında inkübe edin.
   7. Kaplanmış EB'lerdeki ortamı 2-3 hafta boyunca her 3-4 günde bir değiştirin.
   8. 2-3 hafta sonra, EB'ler yapışık olmayan hematopoietik hücreleri süspansiyona bırakmaya başlar.
      not: Bu süspansiyon hücresi salınım periyodu değişebilir ve hücre hattına bağlıdır. Bu süspansiyondaki hücreler toplanabilir ve makrofajlara olgunlaştırılabilir (bakınız Aşama 3) (Şekil 2A).
4. Aşama 3: Terminal makrofaj olgunlaşması
   1. Süspansiyon hematopoietik hücrelerini toplayın ve EB plakasındaki ortamı (Aşama 2 ortamı) doldurun.
   2. Süspansiyon hücrelerini 3 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
   3. Aşama 3 ortamında süspansiyon hücrelerini yeniden askıya alın (100 ng / mL CSF1, 2 mM glutamax ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş X-VIVO15).
   4. Plaka toplandı ve hücreleri, 0.2 x 10⁶ hücre / mL yoğunlukta işlenmemiş plastik 10 cm bakteriyolojik dereceli plakalar (10 mL) veya kaplanmamış 6 oyuklu doku kültürü plakaları (3 mL) üzerine döndürdü.
   5. Hücreleri 9-11 gün boyunca Aşama 3 ortamında tutun ve her 5 günde bir ortam değiştirin.
      not: Aşama 3'teki 1.4.1–1.4.5 adımları her 3-4 günde bir tekrarlanabilir ve süspansiyon hücreleri orijinal EB plakasından 3 aya kadar toplanabilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Olgun fonksiyonel makrofajlara iPSC farklılaşmasının grafik özeti. Biorender ile çizilen diyagram.

Şekil 2: Makrofajlara doğru iPSC farklılaşması ve iPSC-DM sayısı ve morfolojisi. (A) (Soldan sağa) elde edilen Parlak Alan görünt...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
CellMask Koyu Kırmızı Plazma Membran Lekesi	Termo Balıkçı	C10046	Kriyoprezervasyon ortamı
Kriyostör CS10	Sigma	C2874 Serisi
CTS CELLstart Yüzey	Canlandırıcı	A1014201	Kök hücre substratı
Domuz Derisi Jelatini	Sigma	G9136
Rekombinant İnsan BMP4 Proteini	AR-GE	314-BP-010
Rekombinant İnsan IL3	Preprotech (Teknolojik Teknoloji)	0200-03-10
Rekombinant İnsan MCSF (taşıyıcısız) 100ug	Biyoefsane	574806
Rekombinant İnsan VEGF Proteini	AR-GE	293-VE-010
SCF (C-Kit Ligandı) Rekombinant İnsan Proteini	Termo Balıkçı	PHC2111
StemPro hESC SFM	Termo Balıkçı	A1000701
StemPro EZPassage Tek Kullanımlık Kök Hücre Geçiş Aracı	Termo Balıkçı	23181010
Ultra düşük bağlantı plakaları: Hücre kültürü çok kuyulu plaka, 6 oyuklu, hücre yıldızı hücre itici yüzey	Greiner	657970
2-Merkaptoetanol (50 mM)	Canlandırıcı	31350010
DPBS, kalsiyum, magnezyum (500ml)	Termo Balıkçı	14040091
GlutaMAX Takviyesi	Termo Balıkçı	35050061