$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
Tüm hayvan deneyleri, Kaliforniya San Francisco Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüştür.
1. Deneysel farelerden lomber DRG toplayın
- Deneye başlamadan önce, 9 hacim ortamı 1 hacim Ca++/Mg++ içermeyen 10x HBSS ile karıştırarak yoğunluk gradyan ortamının (örneğin Percoll) çalışma çözeltisini hazırlayın. Buz üzerinde tutun.
- Fareyi% 2.5 Avertin ile uyuşturun. Arka pençe tutamına yanıt verilmemesi nedeniyle hayvanın tamamen uyuşturulduğunu onaylayın.
NOT: 6-8 haftalık hem erkek hem de dişi fareler kullanıldı.
- Fareyi 10 mL önceden soğutulmuş 1x PBS ile transkardiyal olarak perfüze edin.
- Fareyi, kimyasal bir çeker ocak içindeki bantla sabitlenmiş dört pençe ile sırtüstü pozisyona getirin. Forseps ile göğüs kafesinin altındaki cildi kaldırın ve karaciğeri ve diyaframı ortaya çıkarmak için cerrahi makasla küçük bir kesi yapın.
- Diyaframı ve göğüs kafesini kesmek için makas kullanmaya devam edin ve atan kalbi ortaya çıkarmak için plevral boşluğu açın.
- Sağ atriyal apendiksiyi iris makası ile hızlı bir şekilde kesin. Kanama fark edildikten sonra, sol ventrikülün arka ucuna 30 G'lik bir iğne yerleştirin ve hayvanı perfüze etmek için yavaşça 10 mL önceden soğutulmuş 1x PBS enjekte edin.
- Yüzüstü pozisyonda yerleştirilen fareye dorsal laminektomi yapın.
not: Hücre kültürü planlanıyorsa, insizyondan önce fareye% 70 etanol püskürtün ve diseksiyon için önceden sterilize edilmiş cerrahi aletler kullanın.
- Torasik bölgeden sakral bölgeye kadar uzunlamasına yanal derin bir kesi yapmak için 11 numara bir neşter kullanın. Sırt kas tabakasını ortaya çıkarmak için cildi makasla çıkarın.
- Lumbosakral omurga süreçleri ve bilateral enine süreçler açığa çıkana kadar bağ dokularını ve kasları soymak için Friedman-Pearson Rongeur kullanın.
- Dorsal omurgayı dikkatlice açmak için bir Noyes Yaylı Makas kullanın, ardından sağlam omurilik sinirleri bağlı omuriliği ortaya çıkarmak için omur kemiklerini çıkarmak için bir Friedman-Pearson Rongeur'a geçin.
- İpsilateral ve kontralateral lomber DRG'yi (çalışmamızda L4/L5 DRG) dikkatlice inceleyin ve Dounce doku homojenizatöründe 1 mL buz gibi Ca++/Mg++ içermeyen 1x HBSS'ye yerleştirin. Artık dokular adım 2.
için hazırdır.
not: Mümkünse DRG'ye bağlı omurilik sinirini kesin.
2. Tek hücreleri fare bel DRG'sinden izole edin
- DRG dokusunu Dounce homojenizatörde gevşek bir havaneli ile 20-25 kez homojenize edin.
- Steril 50 mL'lik bir konik tüpe steril bir 70 μm naylon hücre süzgeci yerleştirin. Hücre süzgecini 800 μL buz gibi 1x HBSS ile ıslatın ve akış konik tüpte toplanır.
- Homojenizatörden homojenize doku süspansiyonunu bir pipet kullanarak toplayın ve ıslak 70 μm naylon hücre süzgecinden 50 mL konik tüpe geçirin.
- Homojenizatörü 800 μL buz gibi soğuk 1x HBSS ile iki kez durulayın ve ardından verimi artırmak için bir hücre süzgeci ile aynı 50 mL konik tüpe boşaltın.
- Steril 5 mL polistiren FACS tüpüne 1.5 mL dengelenmiş buz gibi soğuk izotonik yoğunluk gradyan ortamı (adım 1.1'de hazırlanır) ekleyin.
- Hücre homojenatını 50 mL konik tüpten (adım 2.4'te) FACS tüpüne aktarın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek yoğunluk gradyan ortamı ile iyice karıştırın. Üst kısmı kapatmak için 500 μL 1x HBSS daha ekleyin.
- Hücreleri 4 ° C'de 20 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
- FACS tüpünün altındaki hücre peletini bozmadan ortamdaki miyelin içeren süpernatanı dikkatlice aspire edin.
- FACS analizi için% 5 Fetal sığır serumu (FBS) içeren PBS veya FACS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın.
not: Bir farenin L4 / L5 DRG'sinden en az 50.000 ila 100.000 hücre beklenir.
- Mekanik olarak izole edilen DRG hücrelerini (L4 / L5)% 5 Fetal Sığır Serumu içeren 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve daha sonra karanlıkta 4 ° C'de 1 saat boyunca α fare CX3CR1-APC antikoru (1: 2.000) ile inkübe edin.
- Hücreleri 5 mL PBS ile bir kez yıkayın; hücreleri 360 x g'da 8 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin, ardından FCAS analizi için hücre peletini 300 μL PBS'de yeniden süspanse edin. Hücre sıralaması planlanıyorsa, bunun yerine FACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın.