Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Cerrahi Eksizyon ve Doku Hazırlama Adımları:
- İnce bağırsağın (SI) cerrahi olarak çıkarılması
- CO2 asfiksiasyonu veya kurumsal hayvan etik komitesi tarafından onaylanan herhangi bir eşdeğer yöntem kullanarak farelere ötenazi yapın.
- Fareyi cerrahi eksizyon için özel bir alana aktarın. Arka tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve karnı% 70 etanol ile sterilize edin. Karın derisini ve karın zarını orta hat boyunca pubisten göğüs kafesine kadar keserek laparotomi yapın, böylece periton boşluğu açılır.
not: Periton boşluğuna nüfuz etmekten ve bağırsak dokusuna zarar vermekten kaçınmak için ilk kesiyi cildin nispeten küçük bir bölgesinde gerçekleştirin. İstenilen anatomik sınıra kadar eksizyona devam edin.
- İnce bağırsağın distal segmentini oluşturan terminal ileumun tespiti için ideal bir dönüm noktası olan çekumu tanımlayın.
not: Caecum genellikle farenin karnının sol alt tarafında bulunur.
- İleocekal bileşkeyi tam olarak belirleyin ve ince bağırsağı çekumdan ayırmak için bu seviyede mümkün olduğunca distal bir kesi yapın. Sonraki adımlar boyunca, bağırsak duvarı ile aşırı fiziksel temastan kaçının, çünkü kırılgan PP'ler dokunulduğunda kolayca çöker.
- Mezenteri makas kullanarak keserek pilor sfinkterine kadar tüm ince bağırsağı nazikçe çıkarın. Pilor ve duodenum arasındaki bağlantıyı belirleyin ve duodenumu bu seviyede kesin, bu da ince bağırsağın karın boşluğundan tamamen ayrılmasına yol açacaktır.
NOT: (i) Bağırsak duvarının yırtılmasına neden olabileceğinden hiperekstansiyondan kaçının. (ii) PP lenfositlere ek olarak LP lenfosit izolasyonu isteniyorsa, mezenterik yağın tamamen çıkarılması gerekir. Bununla birlikte, sadece PP izolasyonu için, kalan mezenterik yağ, daha sonraki izolasyon adımları sırasında bazı faydalar sağlayabilir; Bu nedenle korunmalıdır.
- Ayrılmış ince bağırsakları soğuk RPMI +% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile doldurulmuş 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve tüm bağırsak segmentleri soğuk ortama batırılana kadar dokuları manuel olarak hafifçe çalkalayın. Sonraki adımlar boyunca dokuları buz üzerinde tutun.
- İstenilen sayıda fare ince bağırsağını inceledikten sonra, toplanan ince bağırsaklardan PP eksizyonuna devam edin.
- PP'lerin Cerrahi Eksizyonu ve Tek Hücreli Süspansiyonun Hazırlanması:
- Forseps kullanarak mezenterik yağı kavrayarak ve mezenterik tarafı kağıt havluya bakacak şekilde yerleştirerek ince bağırsağı bir kağıt havlu üzerine nazikçe aktarın. Doku dehidrasyonunu ve yapışkanlığını önlemek için tüm bağırsak segmentini soğuk RPMI +% 10 FBS ile nemlendirin.
not: Kalan mezenterik yağ bu aşamada yardımcı olabilir, çünkü SI'nın mezenterik tarafındaki yağ dokusu segmentleri, anti-mezenterik tarafı yukarı bakacak şekilde kağıt havluya yapışacaktır.
- Bağırsak duvarının anti-mezenterik tarafında "karnabahar benzeri" bir şekilde beyaz çok loblu agregalar olarak görünen PP'leri tanımlayın.
not: Tüm PP'ler eksize edilene kadar luminal içeriğin boşaltılması önerilmez. Luminal içeriğin boşaltılması, PP'lerin çökmesine neden olabilir ve PP'ler ile bağırsak duvarı arasındaki renk kontrastını önleyecektir, bu da PP'lerin görsel olarak tanımlanması için çok yararlıdır.
- Antimesenterik taraftaki PP'leri belirledikten sonra, cerrahi kavisli uçlu makası PP'lerin üzerine yerleştirin (eğri yukarı bakmalıdır) ve PP'yi distal ve proksimal sınırından uzaklaştırın.
opsiyonel: PP'yi parmak ucunuzu kullanarak yavaşça makas bıçaklarına doğru itin. Bu manevra, çevredeki PP olmayan dokunun daha iyi dışlanmasına yol açacaktır. PP'leri çevredeki bağırsak dokusu hariç olmak üzere nazikçe eksize edin.
NOT: (i) Bu adım, yine T hücreleri açısından zengin olan LP ve bağırsak epiteli gibi komşu bağırsak bölmelerinden hücre kontaminasyonunu en aza indirirken maksimum PP hücre verimi elde etmek için çok önemlidir. (ii) Bir C57BL / 6 fareden eksize edilen bir SI'dan 5-10 PP (ortalama boyut, çok loblu) toplanabilir. Daha da küçük PP'leri (çok kanallı olmayan) hedefleyerek, bu protokolü kullanarak fare başına 12-13 PP'ye kadar (C57BL/6) toplamak mümkündür.
- Eksize edilen PP'leri buz gibi soğuk RPMI +% 10 FBS ile doldurulmuş 12 oyuklu bir doku kültürü plakasına aktarın ve forseps veya kavisli cerrahi makas kullanılarak buz üzerinde tutulun.
NOT: (i) PP'lerin eksizyonundan hemen sonra, PP yüzeyindeki mukus ve bağırsak içeriği, dokuyu bir kağıt havluya hafifçe sürterek temizlenebilir. Bu adım, PP lenfositlerinin canlılığını artırmaya yardımcı olacaktır. (ii) PP'lerin bir plakaya aktarılması yerine, toplam numune sayısına bağlı olarak ayrı tüplere aktarılması da düşünülebilir.
- İsteğe bağlı: PP eksizyonu ve ardından kuyu plakasına yerleştirme tamamlandığında, farklı deneysel/fare gruplarından toplanan PP'lerin sayısı ve boyutu, PP'leri içeren doku kültürü plakasının bir resmi çekilerek belgelenebilir.
- 25 mL RPMI +% 10 FBS (37 ° C'de önceden ısıtılmış) ile doldurulmuş 50 mL konik tüplerden oluşan bir set hazırlayın. Bir makas kullanarak, 1,000 μL'lik bir ucun kenarını 1 mL'lik bir pipet ile PP'lerin aspirasyonuna izin verecek mesafeden kesin. PP'leri 1 mL'lik bir pipetle aspire edin ve 12 oyuklu doku kültürü plakasından hazırlanan 50 mL'lik konik tüplere aktarın.
not: Numuneler arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için her fare numunesi için yeni bir uç kullanın.
- Kapağı sabitleyin ve tüpleri 37 °C'de, 125–150 rpm'de 10 dakika boyunca sürekli çalkalama ile dikey olarak bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin. Bu arada, 50 mL'lik yeni bir tüp seti hazırlayın ve her tüpün üstüne 40 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin, bu sayede tek hücreli süspansiyon hazırlanacaktır.
NOT: (i) Ajitasyon adımı, çıkarılmadığı takdirde hücre canlılığını ve PP lenfositlerinin geri kazanılmasını azaltan kalan bağırsak içeriğini, mukusu ve hücre kalıntılarını ortadan kaldıracaktır. (ii) PP dokusuna herhangi bir sindirim enzimi uygulamayın, çünkü sindirim işlemi hücre yüzeyinden dramatik bir CXCR5 ekspresyon kaybına neden olur.
- Çalkalamadan sonra, PP'leri yeni hazırlanan konik 50 mL tüplerin üstüne yerleştirilen 40 μm hücre süzgecine aktarın. 10 mL'lik bir şırınga pistonunun yuvarlak tarafını kullanarak, tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için PP'leri hücre süzgecinden nazikçe parçalayın. Süzgeci 15–20 mL soğuk RPMI + %10 FBS.
ile durulayın
NOT: (i) Filtrelemeden önce, PP'leri içeren tüpleri yatay olarak sallayın. Bu kısa çalkalama, PP'lerin hücre süzgeçlerine transferini kolaylaştıracaktır. (ii) Lenfoid olmayan bağışıklık hücrelerinin (örn., monositler, makrofajlar, DC'ler) izolasyonu için 70 μm'lik bir hücre süzgeci kullanılması önerilir.
- Tek hücreli süspansiyonları 350–400 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice atın ve hücreleri 10 x 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.