İnsan Buffy Paltolarından Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İzolasyonu

Özet

Kaynak: Mily, A., et al. M1 ve M2 İnsan Monosit Türevi Hücrelerin Polarizasyonu ve Mycobacterium tuberculosis Enfeksiyonu Üzerine Flow Sitometri ile Analizi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, monositler ve lenfositler içeren periferik kan mononükleer hücrelerinin, PBMC'lerin yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile bir insan buffy tabakasından izolasyonunu gösteriyoruz. İzole edilmiş PBMC'ler daha fazla analiz için kullanılabilir.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Medyanın hazırlanması

>NOT: Tüm reaktifler ve sarf malzemeleriyle ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. RPMI tam ortam: RPMI 1640'ı 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES ve% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile destekleyin. Mtb enfeksiyonu ile çalışırken hücre kültürü ortamındaki antibiyotiklerden kaçının.
2. Serumsuz RPMI ortamı: RPMI 1640'ı 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin ve 10 mM HEPES ile destekleyin.

2. Buffy coats'tan periferik kan mononükleer hücre izolasyonu

>NOT: Tüm çalışmaları insan kanıyla (potansiyel olarak bulaşıcı) sınıf II biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirin. Kalan kan ürünlerini atmadan önce 15 dakika dezenfektanlarla etkisiz hale getirin. Bu durumda sağlıklı gönüllülerden kan elde edildi. Bu in vitro makrofaj farklılaşma protokolü, 10 x 10⁶ izole PBMC/donör/kuyu içerecek şekilde ayarlanmıştır. Her donörden, bir buffy coat yaklaşık 50 mL tam kandan kaynaklanan konsantre bir lökosit süspansiyonu içerir, bu normalde 500-800 x 10⁶ PBMC sağlar ve bunlardan yaklaşık %10 veya 50-80 x 10⁶ monosit alınabilir.

1. 50 mL'lik bir tüpte hazırlanan 15 mL yoğunluk gradyan ortamının üzerine 15 mL buffy-coat kanı yükleyin. Pipet ucunu tüpün duvarına yaslayarak kanı yoğunluk gradyan tabakasının üzerine yavaşça yerleştirin.
2. Tüpleri 600 x g'da oda sıcaklığında (RT) 25 dakika boyunca 0 hızlanma ve 0 yavaşlama ile döndürün.
   not: Santrifüjlemeden önce kapakları dikkatlice kapatın ve santrifüjlemeden sonra tüp tutucularda olası yayılma olup olmadığını daima kontrol edin.
3. Üst plazma tabakasını steril bir Pasteur pipeti ile çıkarın ve daha sonra mononükleer hücre tabakasını steril bir Pasteur pipeti kullanarak dikkatlice 50 mL'lik yeni bir tüpe toplayın. 50 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için PBMC peletine serumsuz RPMI ortamı ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjlemeden önce tüpü birkaç kez ters çevirerek dikkatlice karıştırın.
4. Süpernatanı dikkatlice atın ve tüpün altını parmakların içinde çevirerek hücre peletini yeniden süspanse edin.
5. PBMC'lerden yoğunluk gradyan ortam kontaminasyonunu gidermek için, 50 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için hücreleri serumsuz RPMI ile 2-3 kez yıkayın. RT'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Hücre süpernatanı şeffaf hale gelene kadar yıkayın.
6. Süpernatanı atın ve hücreleri 20 mL serumsuz RPMI ortamında yeniden süspanse edin.
7. Hücreleri tripan mavisi boyama, manuel olarak bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak sayın. Hücre-tripan mavisi örneğini 96 oyuklu bir plakada karıştırarak tripan mavisi içindeki hücre süspansiyonunu 1: 2 veya 1: 10 seyreltmede seyreltin, ör., 50 μL + 50 μL (hemositometre sayımı için) veya 10 μL + 10 μL (otomatik hücre sayımı için) ve canlı hücre sayısını elde etmek için hücreleri sayın.
   Dikkat: Tripan mavisi toksiktir ve ayrı bir kimyasal atığa atılmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Lenforep	Alere Teknoloji A.Ş.	11508545
dev/dak 1640	Yaşam Teknolojileri A.Ş.	SH30096.01
Erozyon (0,5 M)	Karolinska Üniversite Hastanesi, Huddinge	Yok
Na-piruvat	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	SH300239.01
L-Glutamin	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	SH30034.01
HEPES ÜNİVERSİTESİ	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	SH30237.01
Fetal sığır serumu (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524

Gazetesi Serisi