$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Monosit türevi hücrelerin farklılaşması ve polarizasyonu
- Monositlerin izolasyonu için plastik yapışma kullanın. Kısaca, taze izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC'ler) uygun bir konsantrasyonda 6 oyuklu bir kültür plakasında, örneğin 2 mL serumsuz RPMI ortamında 10 x 106 PBMC / kuyu tohumlayın (RPMI 1640'ı 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin ve 10 mM HEPES ile destekleyin) ve 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- 2-3 saat sonra, yapışmayan hücreleri bir pipetle çıkarın ve kuyucukları 1 mL serumsuz ortamla 3 kez yıkayın. Bağlı hücreler monositlerdir ve kuyuya eklenen toplam PBMC'lerin yaklaşık% 10'unu oluşturur, yani kuyu başına eklenen 10 x 106 PBMC'den alınan 106 monosit.
- Makrofaj farklılaşması için, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için sırasıyla 50 ng/mL GM-CSF veya M-CSF içeren bir çalışma çözeltisi hazırlayın ve oyuk başına 2 mL RPMI tam ortama ekleyin. Hücreleri 3 gün boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde kültürleyin.
- 3. günde, 1 mL hücre kültürü ortamını her bir oyuğun üst katmanından dikkatlice çıkarın ve hücre kültürlerini, 50 ng / mL nihai konsantrasyon elde etmek için çift konsantrasyonlu M-CSF veya GM-CSF içeren 1 mL taze RPMI tam ortamı ile destekleyin. Büyüme faktörlerini 100 ng / mL / kuyucuklu önceden hazırlanmış bir çalışma çözeltisine ekleyin.
- 6. günde, tamamen polarize ve olgun M1 (interferon-γ; IFN-γ ve lipopolisakkarit; LPS (E. coli O55:B5)) veya M2 (interlökin 4; IL-4) makrofajları. M1 polarizasyonu için, IFN-γ ve LPS'yi RPMI tam ortamda hazırlayın (RPMI 1640'ı 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES ve %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile destekleyin) ve hücre kültürlerinde 50 ng/mL IFN-γ ve 10 ng/mL LPS'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için kuyu başına 50 μL ekleyin. M2 polarizasyonu için, IL-4'ü RPMI tam ortamında hazırlayın ve hücre kültürlerinde 20 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için oyuk başına 50 μL ekleyin.
- M0 polarize makrofajların farklılaşması için, hücreleri herhangi bir ek sitokin olmadan (M2 benzeri bir fenotip sağlar) sadece M-CSF ile uyarın.
Daha - küçük monositlerin daha büyük makrofaj benzeri hücrelere farklılaştığından emin olmak için monositten türetilmiş hücre kültürlerinin morfolojisini ışık mikroskobu ile düzenli olarak kontrol edin. Ayrıca, M1 ve M2 polarizasyonu arasındaki potansiyel morfolojik farklılıkları, yani daha yuvarlak bir şekle sahip M1 hücrelerine kıyasla uzamış ve gerilmiş M2 hücrelerini izleyin.