Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. AC-6 Besleyici hücrelerinin hazırlanması
Not: AC-6.21 (kısaca AC-6) stromal hücre hattı (I. Weissman, Stanford Üniversitesi tarafından sağlanan), %15 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş RPMI'de tutulmalıdır. Besleyici hücreler olarak hizmet etmek için, AC-6 hücreleri, çoğalmalarını önlemek için ko-kültürden bir gün önce 3.000 rad (30Gy) ile γ ışınlanır. AC-6 hücrelerinin, bakım sırasında aşırı kalabalık bırakılırsa veya geçiş sayıları 20'nin üzerindeyse, farklılaşmayı destekleme yeteneklerini kaybetme eğiliminde olduklarını unutmayın.
- AC-6 hücrelerini 1 ml Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile bir kez yıkayın ve DPBS'yi aspirasyon ile çıkarın. AC-6 hücrelerini 0.8 ml tripsin çözeltisi (DPBS'de% 0.05 tripsin ve 0.5 mM EDTA) ile 37oC,% 5 CO2'de 3-5 dakika tedavi edin ve daha sonra reaksiyonu durdurun tek hücreli süspansiyon yapmak için 10 hacim kültür ortamı ile seyreltin.
- AC-6 hücrelerini 5.9x104 hücre/kuyuda 12 oyuklu plakalara tohumlayın ve 37oC,% 5 CO2 O / N.
'de inkübe edin
not: AC-6 hücrelerinin yoğunluğu çok önemlidir, çünkü daha düşük bir yoğunluk cDC üretimini destekleyecektir. 5.9x104 hücre/kuyu yoğunluğunda tohumlama, AC-6'nın ertesi gün birleşmeye ulaşmasına izin verecektir, bu da CLP'lerden pDC'lerin türetilmesi için en uygun olanıdır.
- AC-6 hücrelerini γ-irradiator.
kullanarak 3.000 rad'da (30 Gy) ışınlayın
Not: AC-6'yı ışınlamak için kullanılan doz, hücrelerin çoğalmasını önlemek ve yine de DC'lerin CLP'lerden farklılaşması için gereken sitokinleri ve hücre-hücre temasını sağlayacak kadar uzun süre canlı kalmalarını sağlamak için optimize edilmiştir.
- Besiyerini aspire edin ve 1 ml tam RPMI (% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS, 50 μg / ml gentamisin ve 50 μM β-merkaptoetanol) ile değiştirin.
2. BM Hücrelerini Farelerden İzole Edin
- CO2 boğulması ve servikal çıkık ile fareleri feda edin. Fareleri bir diseksiyon tepsisine yerleştirin ve %70 etanol ile sterilize edin. Karnın ortasında bir kesi yapın ve alt ekstremiteleri kaplayan deri de dahil olmak üzere farenin distal kısmından cildi çıkarın.
- Fareleri yarı steril bir başlıkta inceleyin. Femur ve tibiaları serbest bırakmak için, uyluk kemiğini diz ekleminin üstüne ve tibiaları diz ekleminin altına klipsleyin. Makas kullanarak kasları kemiklerden ayırın ve kemikleri 5 ml tam RPMI içeren 6 cm'lik bir petri kabına yerleştirin.
- Steril bir kültür başlığına geçin. 27G iğneye bağlı 3 ml'lik bir şırıngayı tam RPMI ile doldurun. Kemiklerin her iki ucunu makas kullanarak kesin ve her iki uçtan bir kez tam RPMI'yi nazikçe enjekte ederek iliği kemiklerden temizlemek için 27G iğnesini sokun.
- İğnesiz şırınga kullanarak hücreleri kültür kabında 3-5 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın.
- Hücreleri 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.
- 1 ml ACK tamponu (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) ile kırmızı kan hücrelerini 1 dakika inkübe edin ve 10 hacim tam RPMI ile seyrelterek reaksiyonu durdurun. Ölü hücre kümelerini ve doku kalıntılarını yerçekimi ile temizlemek için hücrelerin 5 dakika beklemesine izin verin.
not: 5 dakikadan fazla beklemeyin çünkü bu, canlı hücrelerin yerleşmesi nedeniyle hücre kaybına neden olur.
- Hücre içeren süpernatanı yeni bir tüpe yavaşça boşaltın ve orijinal tüpte geride kalıntı bırakın.
- Hücreleri peletlemek için 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı çıkarın ve atın.
- Toplam BM hücrelerini (tipik olarak bir fareden 4-6 x 10,7 BM hücresi elde edilir) 100 μl FACS tamponunda (1x PBS +% 2 FBS + 1mM EDTA) yeniden askıya alın
.
>3. CLP'lerin FACS Analizi ve Sıralanması
- Fc reseptörlerini bloke etmek için FACS tamponundaki (adım 2.9) hücrelere 1-2 dakika boyunca anti-CD16 / 32 (hibridoma süpernant klonu 2.4G2, 50 μl / reaksiyon veya 1-2 μg / reaksiyon) ekleyin.
not: Anti-CD16/32, granülositler, monositler ve B lenfositleri dahil olmak üzere Fc reseptörlerini eksprese eden hücrelere antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için eklenen Fc bloğu olarak da adlandırılır.
- Hücreleri, ortam ışığından kaçınarak buz üzerinde 15 dakika boyunca aşağıdaki floresan boya etiketli antikorlarla (4x107 hücre için) aynı anda boyayın. Antikorlar: Anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6) dahil olmak üzere PE konjuge soy belirteçleri (her biri 0.2 μg). 7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti-Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119) ve anti-MHC-II (NIMR-4), 0.2 μg anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 μg anti-Sca-1-FITC (D7), 0.4 μg anti-M-CSFR-APC (AFS98) ve 0.2 μg anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34).
- Hücreleri 3 ml FACS tamponu ile yıkayın ve 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Hücreleri 300 μl FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri 40 μM'lik bir hücre süzgecinden süzün.
- Kalan hücreleri geri kazanmak için tüpü ek bir 100 μl FACS tamponu ile yıkayın ve aynı hücre süzgecini kullanarak steril bir FACS ayırma tüpüne süzün.
- Sinyal algılama için uygun filtreler ve voltajlar kullanarak boyamadan hemen sonra akış sitometrik analizi yapın. FITC-, PerCP-Cy5.5 etiketli antikorları tespit etmek için 488 nm lazer, PE ve PE-Cy7 etiketli antikorları tespit etmek için 561 nm lazer ve APC etiketli antikoru tespit etmek için 633 nm lazer kullanın.
- CLP'leri aşağıdaki işaretlere göre sıralayın: lin-c-kit intSca-1intM-CSFR-IL-7Rα+ (adım 3.2'de boyandığı gibi) bir hücre sıralayıcı kullanarak. Sıralanan hücreleri, yastık olarak 8 ml tam RPMI içeren 15 ml'lik bir tüpte toplayın.
- Çalıştırmanın sonunda hücre sıralayıcısı tarafından gösterildiği gibi sıralanmış hücrelerin mutlak sayısını kaydedin. Tipik olarak, bir farenin BM'sinden 5x104 CLP elde edilebilir.
4. Kokültür CLP'leri ve AC-6
- Sıralanan hücreleri adım 3.7'den itibaren 500 x g'da 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve yaklaşık 5x104 hücre / ml'lik bir hücre yoğunluğu elde etmek için hücre peletini yeterli tam RPMI ile yeniden süspanse edin. Adım 1.4'te hazırlanan besleyici hücreleri içeren 12 oyuklu plakaya 500 hücre / kuyu tohumlayın.
- 100 ng / ml FL ekleyin (M. Manz, Zürih Üniversite Hastanesi, İsviçre tarafından sağlanan bir ekspresyon sistemi kullanılarak kurum içinde üretilen hu-Flt3L-Ig) ve mikroskop altında DC gelişiminin periyodik görsel izlemesi ile 37oC,% 5 CO2'de inkübe edin.
not: Ticari olarak temin edilebilen rekombinant insan FL veya fare FL, DC gelişimini desteklemek için hu-Flt3L-Ig'nin yerine kullanılabilir.
- Süpernatanttaki hücreleri 12. günde toplayın ve elde edilen süpernatanları birleştirerek kuyucukları bir kez 0.5 ml tam RPMI ortamı ile yıkayın. 0.5 ml taze ortam ekleyin ve yapışan hücreleri bir hücre kazıyıcı ile kazıyın.
- Hücre içeren ortamı her iki parçadan birleştirin ve 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı boşaltın ve hücreleri 50 μl FACS tamponunda yeniden süspanse edin. 50 μl anti-CD16 / 32 hibridoma süpernatanı ekleyin ve Fc reseptörlerini bloke etmek için 1-2 dakika inkübe edin.
- Tüm hücreleri aşağıdaki antikorlarla (her biri 0.05 μg) numaralandırın ve boyayın: anti-CD11c-APC (N418), anti-CD11b-FITC ve anti-B220-PE.
- Hücreleri adım 3.3'te anlatıldığı gibi yıkayın ve santrifüjleyin.
- Hücreleri 100 μl FACS tamponunda yeniden süspanse edin, CD11c+'da geçit açın ve cDC'leri (CD11c+CD11b+B220-) ve pDC'leri (CD11c+CD11b-B220+) analiz edin.