İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin (PBMC'ler) İzolasyonu
- Reaktifin Hazırlanması
- PBS/EDTA'yı hazırlayın: fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile destekleyin. Bu çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzülerek sterilize edin. PBS/EDTA'yı kullanmadan önce 4 °C'de saklamanız ve oda sıcaklığına ısıtmanız gerektiğini unutmayın.
- Boyama tamponu hazırlayın:% 2 fetal sığır serumu (FBS), 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) takviyesi. Bu çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzülerek sterilize edin.
- Kan Konisinden Kan Topla
not: Kan konisi, hastaneden trombosit ferezi sonrası toplanan beyaz kan hücresi bileşenlerini içerir. Kan heparin veya EDTA tüplerinde toplanırsa, kanı PBS ile 1: 1 oranında seyreltin ve adım 1.3'e geçin; Eğer bir buffy ceket alınırsa, buffy ceketi PBS ile 1:2 oranında seyreltin ve adım 1.3'e geçin.
- Kanın 50 ml'lik bir tüpe akmasını sağlamak için koninin iki ucunu kesin.
Koninin genellikle 10 ml kan içerdiğini unutmayın.
- Koniyi yıkamak ve 50 ml'lik bir tüpte toplamak için 30 ml PBS / EDTA içeren künt uçlu bir şırınga kullanın.
- Kanı PBS / EDTA ile 80 ml'lik bir son hacme kadar seyreltin.
- PBMC'lerin Yoğunluk Santrifüjleme ile İzolasyonu
- Aliquot 15 ml Ficoll her biri 4 taze 50 ml tüpe.
- Ficoll tabakasının üzerine 20 ml seyreltilmiş kan eklemek için 25 ml'lik bir serolojik pipet kullanın. 50 ml'lik tüpü 45'lik açıyla tutmaya dikkat edin ve interfazı bozmamaya özen gösterin.
- Tüpleri frensiz olarak 805 x g'da 30 dakika, 20 °C'de santrifüjleyin.
- Plazma katmanını çıkarın ve bir Pasteur pipeti ile plazma katmanının hemen altında bulunan PBMC halkasını toplayın. Dört tüp PBMC'yi iki adet 50 ml'lik tüpte birleştirin. PBMC'lerin altındaki saydam katmanın toplanmasını önlemek için not edin.
- PBMC tüpü başına 50 ml'lik nihai hacme PBS/EDTA ekleyin ve 10 dakika, 20 °C'de frenlerle 548 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve her tüpte peleti 25 ml boyama tamponu ile yeniden süspanse edin ve 50 ml'lik bir tüpte birleştirin.
- Frenlerle 367 x g'da 5 dakika, 4 °C'de santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve peleti 10 ml boyama tamponu ile yeniden süspanse edin.
2. Manyetik Ayırma ile Monosit Zenginleştirme
- Hücre Numarasını Belirle
- 20 μl PBMC hücre süspansiyonu alın ve bir sitometre kullanarak canlı hücrelerin sayısını saymak için 20 μl tripan mavisi ile karıştırın.
- 367 x g'da santrifüj hücresi süspansiyonu, frenlerle 10 dakika, 4 °C.
- Süpernatanı tamamen aspire edin ve hücre peletini 80 μl boyama tamponu başına 10:7 hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse edin.
- Manyetik Etiketleme
- 10 7 hücre başına 20 μlCD14 mikro boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve 2-8 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
- 107 hücre başına 1 ml boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 10 dakika, 4 ° C'de frenlerle 367 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı tamamen aspire edin ve hücre peletini 50 μl boyama tamponu başına 10:7 hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.
- Manyetik Ayırma
- En fazla 2 x 108 toplam hücre için orta boy sütun kullanın.
not: Veri sayfasında önerilen toplam hücre sayısına ve CD14+ hücre sayısına göre uygun bir sütun ve ayırıcı seçin.
- Kolonu uygun bir separatörün manyetik alanına yerleştirin ve kolonu 500 μl boyama tamponu ile durulayarak hazırlayın.
- Hücre süspansiyonunu kolona pipetleyin ve 15 ml'lik bir tüp ile kolondan geçen etiketsiz hücreleri toplayın.
- Kolonun altına 15 ml'lik yeni bir tüp yerleştirin ve kolonu 500 μl boyama tamponu ile 3 kez yıkayın. Yıkamalar arasında yeni bir boyama tamponu eklemeden önce kolon haznesinin boş olduğundan emin olun.
- Sütunu ayırıcıdan çıkarın ve 15 ml'lik yeni bir tüpe yerleştirin.
- Kolona 1 ml boyama tamponu pipetleyin. Pistonu (kitte verilir) kolona sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri hemen yıkayın.
- CD14+ hücrelerinin saflığını artırmak için ayrıştırılan fraksiyonu yeni bir sütunda kullanarak 2.3.2 ila 2.3.6 arasındaki adımları tekrarlayın. Adım 3.2 sırasında boncukların kültürde hücrelerden otomatik olarak salınacağını unutmayın.
3. Dendritik Hücrelerin Farklı Aktivasyon Durumlarına Farklılaşması
- Reaktifin Hazırlanması (Tüm Reaktiflerde Endotoksin Seviyesi 0.1 EU/ml'den Az Olmalıdır)
- Hücre kültürü ortamını hazırlayın: RPMI 1640, %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA) ve 0.05 mM 2-merkaptoetanol (2ME) ile desteklenmiştir. Bu çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzülerek sterilize edin.
- Sitokinleri hazırlayın: IL-4 ve GM-CSF'yi hücre kültürü dereceli suda aseptik koşullar altında sırasıyla 0.25 mg / ml'lik bir konsantrasyona kadar sulandırın. Sitokinleri 200 μl'lik mikrosantrifüj tüplerine alın ve -80 °C'de saklayın.
- D3 vitamini stoğunu hazırlayın: D3 vitaminini hücre kültürü dereceli suda aseptik koşullar altında 100 mM'lik bir konsantrasyona kadar sulandırın. D3 vitaminini 1.5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerine alın ve -20 °C'de saklayın.
- Deksametazon stoğu hazırlayın: deksametazonu hücre kültürü dereceli suda aseptik koşullar altında 10 mM'lik bir konsantrasyona kadar sulandırın. Deksametazonu 1.5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerine alın ve -20 ° C'de saklayın.
- LPS'yi hazırlayın: Lipopolisakkaritleri (LPS) hücre kültürü dereceli suda aseptik koşullar altında 1 mg / ml'lik bir konsantrasyona kadar sulandırın. LPS'yi 1.5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerine alın ve -20 °C'de saklayın.
- Farklı MoDC'ler Oluşturma
- 6 oyuklu plakada 200 ng / ml GM-CSF ve 200 ng / ml IL-4 ile desteklenmiş 0.3 - 0.5 x 106 / ml hücre kültürü ortamı konsantrasyonunda 4 set CD14 + monosit tohumlayın. Bunun Gün 0 olduğunu ve her 6 oyuktaki ortam hacminin 2 ml olduğunu unutmayın.
- Hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
- 4. Günde kültürden 850 μl ortamı çıkarın ve 5 dakika, 4 ° C boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 2x (200 ng / ml GM-CSF ve 200 ng / ml IL-4) içeren 1 ml hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Bu hücre karışımını tekrar kültüre ekleyin. GM-CSF ve IL-4 için eklenen 2x konsantrasyonunun, 1 ml ortam kültüre geri eklendiğinde 1x olacağını unutmayın.
- Tolerojenik moDC'ler oluşturmak için 5. günde setlerin ikisine ml orta başına 1 μl D3 vitamini stoğu ve 1 μl deksametazon stoğu ekleyin. D3 vitamininin nihai konsantrasyonunun 100 nM ve deksametazonun 10 nm olduğunu unutmayın; 5. günde GM-CSF ve IL-4'ün eklenmesi gerekli değildir.
- 6. Günde tüm setlere 200 ng/ml GM-CSF ve 200 ng/ml IL-4 ekleyin.
- Olgun moDC'ler oluşturmak için 6. günde sadece GM-CSF ve IL-4 ile muamele edilen setlerden birine 1 μg/ml LPS ekleyin.
- LPS tolerojenik moDC'ler oluşturmak için 6. günde bir tolerojenik moDC setine 1 μg/ml LPS ekleyin.
- Akış sitometrisi veya diğer çalışmalar için kültür kabını PBS, EDTA ile yıkayarak 7. günde farklı moDC türlerini hasat edin. Yalnızca yapışmayan hücrelerin toplandığına dikkat edin. Olgunlaşmamış moDC'ler, olgun moDC'ler, tolerojenik moDC'ler ve LPS tolerojenik DC'ler için CD14+ monositlerinden elde edilen yüzde verimin sırasıyla yaklaşık %90, %50, %60 ve %60 olduğunu ve kan bağışçıları ile FBS lotu arasında değiştiğini unutmayın.
