İnsan Periferik Kanından B Hücrelerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Tzeng, S. J. Kandan İnsan Antikor Salgılayan B Hücrelerinin İzolasyonu, Farklılaşması ve Miktarının Belirlenmesi: Humoral Bağışıklığın İşlevsel Bir Okuması Olarak ELISpot. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, B olmayan hücrelere özgü biyotinile antikorlar ve streptavidin konjuge manyetik mikro boncuklar kullanarak B hücrelerinin insan periferik kanından izolasyonunu gösteriyoruz.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir

1. İnsan Periferik Kan B Hücrelerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması

1. Median kübital venden (dirseğin önündeki kübital fossada) K₂EDTA (1.5 ila 2.0 mg / mL kan) içeren 15 mL'lik bir tüpe ~ 10 mL kan çekin ve pıhtı oluşumunu önlemek için tüpü hemen birkaç kez ters çevirin.
2. 35 mL otoklavlanmış (121 °C, 15 dakika) kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ ve 1 mM EDTA; pH 7.4) ekleyin taze kan örneğini içeren tüpe (≥ 3: 1 hacim / hacim) ve oda sıcaklığında (RT) en fazla 5 dakika inkübe edin.
   not: Tüpten ışık geçirgenliğinin ortaya çıkması, RBC lizizinin tamamlandığını gösterir.
3. RT'de 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Peletin renginin beyaz olduğundan emin olun.
4. Peletleri 10 mL otoklavlanmış fosfat tamponlu salin (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄ ve 1.47 mM KH₂PO₄; pH 7.4) ile yeniden süspanse edin ve adım 1.3'teki gibi santrifüjleyin.
5. Süpernatanı atın, peleti 10 mL RPMI 1640 ortamı (takviyeler:% 10 fetal buzağı serumu, 100 U / mL penisilin / streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin) ile yeniden süspanse edin ve ardından hücreleri 10 cm'lik bir kültür kabına (tabak başına 10 mL kan) yerleştirin. Çanağı 30 dakika boyunca %5 CO₂ içeren 37 °C'lik bir inkübatöre koyun.
6. Kültür kabını birkaç kez hafifçe döndürün ve kültür ortamını (süspansiyon hücreleri) 15 mL'lik plastik konik tüplere yerleştirin. Kültür kaplarına yapışık hücreleri (çoğunlukla makrofajlar) atın.
7. RT'de 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
8. Peleti 1 mL RPMI 1640 ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre sayısını bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile sayın.
   not: İzole edilmiş lökositlerin canlılığı normalde tripan mavisi dışlaması ile %90'dan fazladır.
9. Adım 1.7'deki gibi santrifüjleyin ve hücreleri ~ 200 μL soğuk PBS tamponunda (% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA) 5 - 10 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
10. Her 10⁶ hücre için kan hücrelerine özgü (B hücrelerinin negatif seçimi için) 5 μL biyotinile anti-insan Ab kokteyli ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika
    not: Anti-insan Ab kokteyli en azından CD2 (veya CD3), CD14 ve CD16'ya özgü Abs içermelidir.
11. Hücrelere 10 kat fazla miktarda steril PBS ekleyin, 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
12. Peletlere eşit miktarda streptavidin konjuge mikro boncuklar (10⁶ hücre başına 5 μL) ekleyin ve iyice karıştırın.
13. 15 mL'lik plastik konik bir tüpte 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
14. Tüpe 2 mL PBS tamponu ekleyin.
15. Tüpü manyetik bir standa yerleştirin ve RT'de 8 dakika inkübe edin. Kahverengi mikro boncuklar, mıknatısın yanındaki tüp duvarına kademeli olarak yapışacaktır.
16. Tüp manyetik standda kalırken, süpernatanı dikkatlice yeni bir steril 15 mL'lik tüpe aktarın.
17. 1.14 ila 1.16 arasındaki adımları tekrarlayın ve el değmemiş B hücrelerini içeren iki süpernatanı birleştirin. Mikro boncukları atın.
18. RT'de 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
19. Aşağı akış deneyleri için peleti RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin.
    not: Tipik olarak, 10 mL periferik kandan% 95'ten daha yüksek bir saflığa sahip 1 - 5 x^{10 5} B hücreleri izole edilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BD Vacutainer K2E	BD Biyolojik Bilimler	367525	10 ml tüp
Ficoll-Paque Artı	GE Sağlık	17-1440-02	Endotoksin içermez
Tripan mavisi% 0.5 çözelti	Biyolojik Endüstriler	03-102-1B	boya
IMag İnsan B lenfosit zenginleştirme seti	BD Biyolojik Bilimler	558007	reaktif
Streptavidin manyetik mikro boncuklar	BD Biyolojik Bilimler	9000810	reaktif
15 ml Falcon tüpleri	BD Şahin	352196	Plastik eşya
Biyotinile CD27 mAb	Biyoefsane	302804	Klon O323
Biyotinile anti-insan CD27	Biyoefsane	302804	Klon O323
Biyotinile anti-insan CD27	eBiyobilim	13-0279-80	Klon O323