$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Naif B Hücreleri, Bellek B Hücreleri ve Plazmablastlar/Plazma Hücrelerinin (PB'ler/PC'ler) Toplanması için Hücre Sıralama
- Saflaştırılmış insan periferik kan B hücrelerini kullanarak, bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayısını belirleyin.
- Hücreleri, 5 mL'lik bir polistiren tüpte mL başına 10:7 konsantrasyonda soğuk PBS tamponunda yeniden süspanse edin.
- 106 hücre başına 1 - 2 μg insan IgG ekleyin ve Fc bloğu için 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- 106 hücre başına 1 μg anti-CD19-APC (klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (klon: O323) ve anti-CD38-PE (klon: HIT2) ekleyin; İyice karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Adım 1.4'teki son 5 dakikada, 5 μL ticari 7-amino aktinomisin D (7-AAD) ekleyin.
- Tüpe, vortekse 2 mL PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.
- Hücreleri, 15 mL'lik bir tüpte mL başına 1 - 5 x 107 hücre konsantrasyonunda sıralama tamponunda (% 2 BSA ve 2 mM EDTA ile steril PBS) yeniden süspanse edin.
- Hücre kümelerini ortadan kaldırmak için hücreleri bir naylon ağ hücre süzgecinden (40 μm gözenek boyutu) süzün.
- Hücreleri üç lazerle donatılmış bir akış sitometrik sıralayıcı ile ayırın: mor (405 nm), mavi (488 nm) ve kırmızı (640 nm).
NOT: Mavi lazer tek başına 3 renkli akış sitometrisi için yeterlidir.
- Naif B hücrelerinin (CD19 + CD27-), bellek B hücrelerinin (CD19 + CD27 +) ve PB'lerin / PC'lerin (CD19 + CD27 + / hiCD38 +) aynı anda toplanması için hücreleri üç adet 15 mL tüpe (5 mL RPMI ortamı içeren) sıralayın.
not: Sıralanmış naif ve bellek B hücreleri daha fazla kültürlenebilir.