$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
İnsan periferik kanı, bilgilendirilmiş onam altında sağlıklı donörlerden alınmalı ve kan örneklerinin kullanımı, inceleme kurulları tarafından belirlenen onaylanmış yönergelere uygun olmalıdır. Bu çalışmada, akış sitometrisi (Şekil 1) ve ELISpot testlerinin (Şekil 2) sonuçlarının bir gösteriminde insan kanını kullanma protokolü.
1. İnsan Periferik Kan B Hücrelerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması
- Median kübital venden (dirseğin önündeki kübital fossada) K2EDTA (1.5 ila 2.0 mg / mL kan) içeren 15 mL'lik bir tüpe ~ 10 mL kan çekin ve pıhtı oluşumunu önlemek için tüpü hemen birkaç kez ters çevirin.
- 35 mL otoklavlanmış (121 °C, 15 dakika) kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 ve 1 mM EDTA; pH 7.4) taze kan örneğini içeren tüpe (≥ 3: 1 hacim / hacim) ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakikadan fazla olmamak üzere inkübe edin.
not: Tüpten ışık geçirgenliğinin ortaya çıkması, RBC lizizinin tamamlandığını gösterir.
- RT'de 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Peletin renginin beyaz olduğundan emin olun.
- Peletleri 10 mL otoklavlanmış fosfat tamponlu salin (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 ve 1.47 mM KH2PO4; pH 7.4) ile yeniden süspanse edin ve adım 1.3'teki gibi santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın, peleti 10 mL RPMI 1640 ortamı (takviyeler:% 10 fetal buzağı serumu, 100 U / mL penisilin / streptomisin, 0.25 μg / mL amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin) ile yeniden süspanse edin ve ardından hücreleri 10 cm'lik bir kültür kabına (tabak başına 10 mL kan) yerleştirin. Çanağı 30 dakika boyunca %5 CO2 içeren 37 °C'lik bir inkübatöre koyun.
- Kültür kabını birkaç kez hafifçe döndürün ve kültür ortamını (süspansiyon hücreleri) 15 mL'lik plastik konik tüplere yerleştirin. Kültür kaplarına yapışık hücreleri (çoğunlukla makrofajlar) atın.
- RT'de 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Peleti 1 mL RPMI 1640 ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre numarasını bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile sayın.
not: İzole edilmiş lökositlerin canlılığı normalde tripan mavisi dışlaması ile %90'dan fazladır.
- Adım 1.7'deki gibi santrifüjleyin ve hücreleri ~ 200 μL soğuk PBS tamponunda (% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA) 5 - 10 x 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
- Her 106 hücre için kan hücrelerine özgü (B hücrelerinin negatif seçimi için) 5 μL biyotinile anti-insan Ab kokteyli ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika
not: Anti-insan Ab kokteyli en azından CD2 (veya CD3), CD14 ve CD16'ya özgü Abs içermelidir.
- Hücrelere 10 kat fazla miktarda steril PBS ekleyin, 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Peletlere eşit miktarda streptavidin konjuge mikro boncuklar (106 hücre başına 5 μL) ekleyin ve iyice karıştırın.
- 15 mL'lik plastik konik bir tüpte 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Tüpe 2 mL PBS tamponu ekleyin.
- Tüpü manyetik bir standa yerleştirin ve RT'de 8 dakika inkübe edin. Kahverengi mikro boncuklar, mıknatısın yanındaki tüp duvarına kademeli olarak yapışacaktır.
- Tüp manyetik standda kalırken, süpernatanı dikkatlice yeni bir steril 15 mL'lik tüpe aktarın.
- 1.14 ila 1.16 arasındaki adımları tekrarlayın ve el değmemiş B hücrelerini içeren iki süpernatanı birleştirin. Mikro boncukları atın.
- RT'de 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Aşağı akış deneyleri için peleti RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin.
not: Tipik olarak, 10 mL periferik kandan% 95'ten daha yüksek bir saflığa sahip 1 - 5 x10 5 B hücreleri izole edilebilir.
2. İzole B Hücrelerinden Bellek ve Naif B Hücrelerinin Saflaştırılması ve Ayrılması
- Adım 1'den saflaştırılmış hücreleri kullanın ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayısını belirleyin.
- 600 x g'da santrifüjlemeden sonra hücreleri 100 μL soğuk PBS tamponunda yeniden süspanse edin ve 5 dakika RT'leyin.
- 106 hücre başına 1-2 μg biyotinile CD27 mAb ekleyin ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Tüpe 10 mL PBS tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücreleri 50 μL PBS tamponunda yeniden süspanse edin.
- 15 mL'lik plastik konik tüpteki hücrelere eşit miktarda streptavidin manyetik mikro boncuklar (1-2 μg / 106 hücre) ekleyin.
- Yavaşça iyice karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Tüpe 2 - 3 mL PBS tamponu ekleyin.
- Tüpü manyetik bir standa yerleştirin ve kahverengi mikro boncukların mıknatısa en yakın tarafa yapışmasını sağlamak için RT'de 8 dakika inkübe edin.
- Tüp manyetik standdayken, süpernatan fraksiyonu dikkatlice yeni bir steril tüpe aktarın. Bu fraksiyon, zenginleştirilmiş CD27-naif B hücrelerini içerir.
- Mikro boncukları içeren tüpe 5 mL ekleyin ve mikro boncukları yavaşça yeniden süspanse edin (yani, CD27 + bellek B hücrelerinin zenginleştirilmiş fraksiyonu).
- RT'de 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Aşağı akış deneyleri için peletleri RPMI 1640 ortamı ile yeniden askıya alın.
not: Tipik olarak, B hücrelerinin ~% 30 - 60'ı, sağlıklı bir donörün PBMC'lerinden CD27 + bellek hücreleri olarak saflaştırılabilir.
3. Naif B Hücreleri, Bellek B Hücreleri ve PB'ler/PC'lerin Toplanması için Hücre Sıralama
- Adım 1'den saflaştırılan hücreleri kullanarak, bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre sayısını belirleyin.
- Hücreleri, 5 mL'lik bir polistiren tüpte mL başına 10:7 konsantrasyonda soğuk PBS tamponunda yeniden süspanse edin.
- 106 hücre başına 1 - 2 μg insan IgG ekleyin ve Fc bloğu için 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- 106 hücre başına 1 μg anti-CD19-APC (klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (klon: O323) ve anti-CD38-PE (klon: HIT2) ekleyin; İyice karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Adım 3.4'teki son 5 dakikada, 5 μL ticari 7-amino aktinomisin D (7-AAD) ekleyin.
- Tüpe, vortekse 2 mL PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.
- Hücreleri, 15 mL'lik bir tüpte mL başına 1 - 5 x 107 hücre konsantrasyonunda sıralama tamponunda (% 2 BSA ve 2 mM EDTA ile steril PBS) yeniden süspanse edin.
- Hücre kümelerini ortadan kaldırmak için hücreleri bir naylon ağ hücre süzgecinden (40 μm gözenek boyutu) süzün.
- Hücreleri üç lazerle donatılmış bir akış sitometrik sıralayıcı ile ayırın: mor (405 nm), mavi (488 nm) ve kırmızı (640 nm).
not: Mavi lazer tek başına 3 renkli akış sitometrisi için yeterlidir.
- Naif B hücrelerinin (CD19 + CD27-), bellek B hücrelerinin (CD19 + CD27 +) ve PB'lerin / PC'lerin (CD19 + CD27 + / hiCD38 +) aynı anda toplanması için hücreleri üç adet 15 mL tüpe (5 mL RPMI ortamı içeren) sıralayın.
not: Sıralanmış naif ve bellek B hücreleri, adım 4'te tarif edildiği gibi kültürlenebilir.
4. İzole İnsan CD19+ B Hücrelerinin, CD19+CD27+ Bellek B Hücrelerinin ve CD19+CD27- Naif B Hücrelerinin İn Vitro Farklılaşması
- Adım 1.19, 2.10, 2.11 ve 3.10'da saflaştırılan hücreleri kullanarak, hücre sayısını bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile belirleyin.
- Hücreleri, mL başına 1 - 10 x 105 konsantrasyonda RPMI 1640 ortamı ile yeniden süspanse edin ve bunları 12 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına ayırın.
- 5 μg / 106 hücre / mL'de CpG (ODN 2006) ekleyin.
- Hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatörde 5 gün boyunca% 5 CO2 ile kültürleyin.
- Hücreleri her bir oyuktan hasat edin, ayrı ayrı 15 mL'lik tüplere yerleştirin, her tüpe 5 mL PBS ekleyin ve 600 x g'da santrifüjleyin ve 5 dakika boyunca RT'de santrifüjleyin.
- Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri, RPMI 1640 ortamı ile mL başına 1 - 10 x10 5 konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
5. ELISpot Testi
- ELISpot plakalarının her bir kuyucuğuna 30 s.
boyunca damıtılmış su içinde 30 μL %35 etanol ekleyin
not: Pipetleme yaparken, her zaman kuyucuklardaki zara dokunmaktan kaçının.
- Etanolü çıkarmak için ELISpot plakalarını ters çevirin.
- Her bir oyuğa 150 μL otoklavlanmış ddH2O koyun ve kalan etanolü temizlemek için RT'de 5 dakika inkübe edin; RT'de 3 dakika boyunca steril PBS'yi
yıkayın
not: 5.1'den 5.3'e kadar olan adımlar, plakaların imalatına bağlı olarak isteğe bağlı olabilir.
- 50 μL 5 μg/mL poliklonal F(ab')2 anti-insan Ig (IgG + IgM + IgA) parçasını (PBS cinsinden) ELISpot plakalarının her bir kuyucuğuna koyun ve gece boyunca 4 °C'de (tercih edilir) veya 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
not: Plakaların kenarlarını kullanana kadar Parafilm ile kapatın.
- Bağlanmamış Abs'yi çıkarmak için plakaları ters çevirin, her bir oyuğa 200 μL PBS ekleyin ve her seferinde 3 dakika boyunca RT'de iki kez inkübe edin.
- Blokaj için her oyucuğa% 5 BSA (veya RPMI 1640 orta) içeren 200 μL PBS ekleyin ve bunları RT'de 2 saat inkübe edin.
- Engelleme tamponunu çıkarmak için plakaları ters çevirin. Adım 5.5'te olduğu gibi her kuyuyu 200 μL PBS ile iki kez yıkayın.
- Her kuyucuğa 100 μL RPMI 1640 ortamı ekleyin ve 37 °C'de inkübe edin.
- Hücreleri tohumlamaya hazır olduğunuzda, RPMI 1640 ortamını çıkarmak için plakaları ters çevirin.
- 100 μL (5 x 104), 50 μL (2,5 x 104) ve 25 μL (1,25 x 104) hücreyi (1.19, 2.10, 2.11, 3.10 ve 4.6 adımlarından) bir ELISpot plakasının kuyucuklarına tohumlayın. RPMI 1640 ortamı ile hacmi 150 μL/kuyuya getirin.
not: Hücrelerin kaplanması için en az bir veya iki 2 katlı seri seyreltme önerilir.
- Plakaları 37 ° C'lik bir inkübatörde% 5 CO2 ile 8 - 14 saat inkübe edin. İnkübasyon sırasında plakaları hareket ettirmekten kaçının.
- Hücreleri ve RPMI 1640 ortamını çıkarmak için plakaları ters çevirin.
- 200 μL/kuyucuk PBS-T (%0,05 Tween 20 ile PBS) ekleyin ve her seferinde 3 dakika olmak üzere RT'de 5 kez inkübe edin. 5 yıkamanın her biri arasındaki yıkama tamponunu çıkarmak için plakayı ters çevirin.
- Keçi anti-insan IgG-alkalin fosfataz (AP), Fcγ'ya özgü Abs (IgG tespiti için, PBS-T'de 1: 5.000) veya keçi anti-insan IgM-AP, Fcμ fragmanına özgü Abs (IgM tespiti için, PBS-T'de 1: 5.000) ekleyin ve karanlıkta 2 saat RT'de inkübe edin.
- Adım 5.5'te olduğu gibi her kuyuyu 200 μL PBS ile iki kez yıkayın.
- 50 μL/kuyu bromokloroindolil fosfat-nitro mavi tetrazolyum (BCIP/NBT) substrat çözeltisi ekleyin. Mor renkli lekeler normalde 5 - 15 dakika içinde ortaya çıkar.
- Lekelerin aşırı gelişmesini önlemek için 100 μL / kuyu ddH2O ekleyin.
- Tüm lekelerin tamamen gelişmesinden sonra plakaları akan musluk suyuyla durulayın.
- Plakaların alt drenajını çıkarın ve karanlıkta kurumaya bırakın.
- Bir görüntü toplama/analiz ünitesine sahip otomatik bir plaka okuyucu (örneğin, otomatik bir tarayıcı veya bir diseksiyon mikroskobu ile manuel olarak) kullanarak noktaları sayın.
not: Plakalar karanlıkta RT'de saklanabilir ve daha sonra analiz edilebilir.
