$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Toplama Tüplerinin Hazırlanması
- Minimum Esansiyel Orta α (MEM α)% 10 Fetal Sığır Serumu ve% 1 Penisilin / Streptomisin ile takviye ederek BMSC kültür ortamını yapın.
- 100 μL BMSC kültür ortamını 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin. 3 kemik genellikle tek bir tüpe sığar, bu yüzden buna göre hazırlanın.
- 200 μL'lik pipet uçlarının uçlarını santrifüj tüplerine sığacak kadar kesin. Uçları tüplerin içine yerleştirin ve tüpleri buzun üzerine yerleştirmeden önce kapakların kapanabildiğinden emin olun.
not: Alternatif olarak, uçları kesilmiş 0.75 mL mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilebilir.
2. Farelerden Kemik Hasadı
- Hayvanları CO2 kullanarak ötenazi yapın, ardından servikal çıkık yapın ve% 70 etanol püskürtün.
not: Aynı cinsiyetten ve tercihen aynı yaştaki hayvanların kullanıldığından emin olun. Rutin olarak 7 ila 8 haftalık hayvanları kullanıyoruz. Daha iyi temsili ve tekrarlanabilir bir hücre popülasyonu elde etmek için deney grubu başına en az 3 hayvandan alınan hücrelerin bir araya getirilmesini öneririz.
- Ötenazi fareyi bir diseksiyon tahtası üzerine sırt üstü yerleştirin. Karın üzerinde bir cilt çadırı oluşturmak için forseps kullanın. Steril diseksiyon makası kullanarak küçük bir kesi (yaklaşık 1 cm) yapın. Alt karın bölgesini ve bacakları ortaya çıkarmak için cildi uzuvlara ve ayaklara doğru kesikten geriye doğru soyun.
- Ayağı çıkarmak için ayak bileği ekleminin altından kesin. Femur başını kalça kemiğinden ayırmak için kalçadaki iliak tepe boyunca kesin. Fare hala sırt üstü yatarken, iki iliak kemiği ayırmak için kalça kemiğinin ortasında bir kesi yapın.
- Tüy bırakmayan mendiller kullanarak kasları femurlardan, tibialardan ve iliak kemiklerden dikkatlice çıkarın.
not: Kemikten mümkün olduğunca çok tendon ve kas kesmek, tüy bırakmayan mendillerle (örneğin, Kim mendilleri) temizliği daha hızlı ve kolay hale getirir. Kemikleri manipüle ederken dikkatli olun, çünkü kolayca kırılma eğilimindedirler ve bazı genotiplerle kırılganlıkları artabilir.
- Tüm numuneler diseke edildikten sonra, bunları buz üzerinde PBS'ye yerleştirin ve kalan izolasyon adımları için steril bir kültür başlığına geçin.
not: Mümkün olduğunca aseptik olarak çalışmak, kültürlerdeki kontaminasyon potansiyelini azaltacaktır.
- Santrifüj tüpleri içindeki kesitli uçlara yerleştirmeden önce kemiklerin hem proksimal hem de distal uçlarında küçük kesikler (yaklaşık 1 ila 2 mm) yapın.
not: İliğin santrifüj edilebilmesi için yeterli miktarda kestiğinizden emin olun; Bununla birlikte, hücre popülasyonları kemik iliği boşluğu içindeki yakınlığa bağlı olarak değişme eğiliminde olduğundan, çok fazla kesmekten kaçınmak için özen gösterilmelidir.
- Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Kemikler eklerin içindeyken (200 μL pipet ucu veya 0,75 mL mikrosantrifüj tüpü) tüm iliğin 1,5 mL'lik tüpün dibinde yıkandığından ve peletlendiğinden emin olun. Tüm ilik toplandıktan sonra, kemiklerin bulunduğu ekleri toplama tüplerinden çıkarın.
not: Tüm ilik kızarırsa, kemikler beyaz görünecektir. Bununla birlikte, ilik belirli kemiklerde kalırsa, uçları tekrar kesmeyi ve santrifüjlemeyi deneyin.
3. Hücre Süspansiyonu
- 25 G'lik bir iğne kullanarak, kümeleri parçalamak için hücre peletlerini yavaşça yukarı ve aşağı çekin ve tüm numuneleri tek bir 15 mL konik tüpte birleştirin. Her 500 μL numune başına 10 mL BMSC Kültür Ortamı ekleyin.
- 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine 70 μm'lik bir filtre yerleştirin ve olası kemik parçalarını çıkarmak için hücre süspansiyonunu bu filtreden geçirin.
4. Kemik İliği Hücrelerinin Karışık Popülasyonlarının Kaplanması ve Kültürü (Toplam BMC'ler)
NOT: Hücreler, %5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de kültürlenir.
- Hücre sayısını hesaplayın ve bunları kültür ortamında 1.0 x 106 hücre/cm2 olarak plakalayın. Hücrelerin bağlanması için 72 saat karışık kültüre izin verin.
not: Hücreleri bir hemositometre kullanarak saymadan önce hücre süspansiyonunun kültür ortamında 20 kat seyreltilmesini ve tripan mavisi içinde tekrar seyreltilmesini öneririz. 7 haftalık erkek C57Bl6 / J fareler için, rutin olarak yaklaşık 50 x 106 hücreli bir hücre sayısı veririz, ancak yaş, cinsiyet ve suş hücre sayısını büyük ölçüde etkileyebilir.
not: Karışık bir hücre popülasyonu, kültür kuyusunun dibine bağlanmalıdır.
- 72 saat sonra ortamı çıkarın ve yeni ortamla değiştirin. Medyayı iki günde bir değiştirmeye devam edin ve birleşip birleşmediğini kontrol edin. Hücreler% 80-100 birleşmeye ulaştığında farklılaşmaya hazırdırlar.
not: Bu kültür hem BMSC'ler hem de HSC'ler ile karıştırıldığından, osteoblastogenez, adipogenez ve osteoklastogenez için doğrudan kullanılabilir.
5. BMSC'lerin (Yapışık BMSC'ler) Bölünmüş Popülasyonunun Kaplanması ve Kültürü
NOT: Hücreler, %5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 °C'de kültürlenir.
- Bir farenin femurlarından, tibialarından ve iliak kemiklerinden toplanan tüm hücreleri 10 cm'lik bir kültür kabına (55cm2 kültür alanı) koyun.
not: 2-3 C57BL / 6J fareyi bir araya getirirken, tipik olarak bu 'toplam' kemik iliği popülasyonunu 150cm2'lik bir şişede kaplarız.
- 48 saatlik karışık kültürden sonra, kültür ortamını (yapışmayan HSC'leri içeren) çıkarın. Osteoklastogenez deneyleri yapılacaksa, bu yapışık olmayan hücre popülasyonunu bir kenara koyun, değilse bu hücreleri aspire edin ve atın.
- Bağlı hücreleri rahatsız etmemek için plakayı/şişeyi PBS ile dikkatlice yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve% 0.25 tripsin ekleyerek ve 37 ° C'de 1-3 dakika inkübe ederek hücreleri kaldırın. Bu noktada, artık kaldırılmış olan BMSC'ler sayılabilir (daha önce adım 4.1'de yapıldığı gibi) ve gelecekteki deneyler için kaplanabilir.
- Kaplama için gereken hücre sayısını hesaplayın. Gerekli hücre süspansiyonu hacmini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
not: Hücreler tipik olarak son nokta deneylerine dayalı olarak kaplanır. Örneğin, protein/RNA izole edilecekse, tipik olarak daha yüksek bir yoğunlukta plaka yaparız (~ 1.0-2.0 x 106 hücre / 6 oyuklu bir plakada kuyu).
- Ortamı çıkarın ve hücre peletini kaplama için gereken kültür ortamı hacminde yeniden süspanse edin. Hücreleri deneylere göre kültür ortamında plakalayın ve birkaç gün tutunmalarına izin verin. BMSC'ler birleştiğinde, farklılaşma gerçekleştirmeye devam edin.
6. BMSC'lerin farklılaşması
- Adipositler
- 90 mL Dulbecco Modifiye Eagle Medium (DMEM) Yüksek Glikoz, 10 mL Fetal Sığır Serumu, 1 mL Penisilin / Streptomisin, 100 μL 20 mM Rosiglitazon ve 100 μL 2 mM İnsülini karıştırarak adiposit bazlı ortam yapın. Gerekirse, bu ortamı farklılaşma deneyi sırasında bir hafta boyunca 4 °C'de saklayın.
- 25 mL Adiposit Baz Ortamına 200 μL 62.5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) ve 25 μL 1 mM Deksametazon ekleyerek adiposit indüksiyon ortamı yapın.
- BMSC kültürleri (adım 4.3'teki toplam BMC'ler veya adım 5.6'daki yapışık BMSC'ler) birleştiğinde, ortamı adiposit indüksiyon ortamına değiştirin. Farklılaşmanın bu 0. gününü düşünün.
- 48 saat sonra, ortamı çıkarın ve kültürü adiposit indüksiyon ortamı ile yenileyin.
- 4. Günde, adiposit bazlı media.
not: Lipid damlacıkları 2. veya 4. gün kadar erken ortaya çıkmaya başlayabilir.
- 7. Günde, hücrelerin maksimum lipid damlacıkları biriktirdiğini ve olgun bir adiposit benzeri bir fenotip gösterdiğini gözlemleyin. Hücre ölümü / dekolmanı ile sonuçlanabileceğinden bu noktadan sonra kültür yapmayın.