Yüzdürme ile aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak yüzdürme tabanlı T hücresi izolasyonu

Özet

Kaynak: Snow, T., et al. Mikro Kabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Flotasyona Dayalı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Genişlemesi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, işlevselleştirilmiş yüzdürme ile aktive edilen hücre sıralama (BACS) teknolojisi kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) T hücresi izolasyonunu göstermektedir. İzolasyon tekniği, hücrelerin biyotinile anti-CD3 antikorları ile işaretlenmesi ve antikora bağlı hücrelerin streptavidin'e bağlı mikro kabarcıklar kullanılarak ayrılması yoluyla CD3+ T hücrelerinin pozitif seçimini içerir.

Protokol

1. Pozitif seçim kullanılarak T hücrelerinin mikro kabarcıklarla izolasyonu

>NOT: Bu protokol, SAMB'leri kullanan küçük ölçekli bir CD3⁺ pozitif seçim yaklaşımını detaylandırır.

1. Ticari olarak elde edilen 3 x 10⁸ PBMC'yi, 1 milyon hücre (25 ng / M) başına 25 ng antikor konsantrasyonunda biyotinile anti-CD3 (OKT3) antikoru ile 2.5 mL ayırma tamponunda inkübe edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
2. Üreticinin bildirdiği SAMB konsantrasyonuna göre 0,5 (SAMB miktarı):1 (hücre miktarı) oranında streptavidin mikro kabarcıkları (SAMB'ler) ekleyin.
3. Oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca 20 rpm'de ticari bir uçtan uca (EOE) döndürücü kullanarak karıştırın. Oda sıcaklığında 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
4. Santrifüjlemeden sonra, pozitif olarak seçilen hücreler SAMB'lerle süspansiyonun en üstünde olacaktır. Kalan seçilmemiş hücreler, tüpün altındaki hücre peletinde olacaktır. 9 inçlik bir cam pipet kullanarak, ucu kabarcık hücre tabakasının altına tüpün dibine yerleştirin, hücre peletini ve subnatanı elektronik bir pipetle aspire edin ve bunları yeni bir tüpe aktarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Biyotin anti-insan CD3 (OKT3) Antikoru	Biyoefsane	317320
Lökopak	BiyoIVT	HUMANLMX100-0001129
Normal İnsan PBMC'leri	BiyoIVT	İNSANHİLHLP-0002562
Streptavidin Mikrokabarcık Kiti (Akadeum'un ayırma tamponunu içerir)	Akadeum	11110-000