İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Aktive edilmiş insan primer T lenfositlerinin kültürlenmesi
- Hücrelerin çözülmesi (1. gün)
- Numune başına 10 mL RPMI 1640'ı yaklaşık 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
- İstenilen sayıda periferik kan mononükleer hücre ampulünü alın ve geçici olarak kuru buz üzerinde saklayın.
- Donmuş hücreleri 10 mL önceden ısıtılmış RPMI 1640'ta yeniden süspanse edin.
- Hücreleri RT'de 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve 1.1.4'te tarif edildiği gibi 10 mL RPMI 1640 ve santrifüjde yeniden süspanse ederek hücreleri tekrar yıkayın.
- Süpernatanı atın ve hücreleri mL başına 2 x 106 hücrede X-VIVO 15 ortamı +% 5 insan serumunda (bundan böyle: T hücresi ortamı) yeniden süspanse edin.
- 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasında oyuk başına 2 mL hücre plakasını plakalayın ve gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Hücrelerin aktivasyonu (Gün 0)
- CD3 / CD28 boncuklarını, 1 milyon hücre başına 12,5 μL boncukları bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak yıkayın. 12,5 μL boncuk başına 12,5 μL PBS ekleyin.
not: Kullanmadan önce boncuk şişesini girdaplamak önemlidir.
- Mikrosantrifüj tüpünü 1 dakika boyunca uygun bir mıknatıs üzerine yerleştirin.
- Tamponu atın ve boncukları T hücre ortamının orijinal hacminde yeniden süspanse edin (orijinal boncuk hacminin 12,5 μL'si başına 12,5 μL T hücre ortamı).
- 1:2 oranına karşılık gelen milyon hücre başına 12,5 μL boncuk ekleyin (boncuklar: hücreler).
- Hücreleri, her birinde yaklaşık 5 milyon hücre bulunan iki koşula bölün.
- Tablo 1'de belirtildiği gibi koşullara doğru hacimde sitokin ekleyin.
- Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 3 gün inkübe edin.
- Hücrelerin kültürlenmesi (3. ve 5. günler)
- Hücreleri yeniden askıya alın ve her bir kuyucuktan gelen hacmin yarısını yeni bir kuyuya aktararak bölün. Her oyuğa aynı hacimde taze T hücresi ortamı ekleyin.
- Tablo 1'de belirtildiği gibi her duruma yeni sitokinler ekleyin.
)
Serisi
| Sitokin | stok | Seyreltme faktörü | son |
| Koşul 1 | IL-2 (İngilizce | 3 x 106 U/mL | 30.000 | 100 U/mL |
| Koşul 2 | IL-15 | 2 x 105 U/mL | 2.000 | 100 U/mL |
Tablo 1: T hücrelerinde metabolik değişiklikleri yönlendirmek için kullanılan sitokin kültürlerinin hazırlanması.
