Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. PDLN'den Tek Hücre İzolasyonu
- Bir raftaki 15 mL'lik konik bir tüpün üzerine 250 μm'lik steril bir metal ağ yerleştirin. Ağı 1 mL RPMI ile durulayın.
- Lenf düğümlerini metal ağa aktarın ve bir cımbız kullanarak ağdan öğütün. Hücreleri tüpe akıtmak için metal ağ üzerine 1 mL RPMI uygulayın. 3 kez daha tekrarlayın ve ağı çıkarın.
- Tüpleri 433 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Hücre peletini yaklaşık 5 mL RPM'de yeniden süspanse edin. Tüpleri RPMI ile doldurun.
- Tüpleri 433 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Hücre peletini yaklaşık 5 mL RPM'de yeniden süspanse edin. Tüpleri RPMI ile doldurun.
- Tüpleri 433 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Hücre peletini 2 mL RPM'de yeniden süspanse edin. 2 mL hücre süspansiyonunu, hücre süzgeci kapakları olan 5 mL yuvarlak tabanlı tüplere aktarın. Hücre süspansiyonunu hücre süzgeci kapaklarına uygulayın.
2. Akış Sitometrisi
- PDLN'lerden hücre süspansiyonlarını 433 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Hücreleri 100 μL akış sitometrisi boyama tamponunda (FACS tamponu) aşağıdaki yüzey antikorları ile boyayın: 0.75 μg / 100 μL FITC konjuge CD4 antikoru, 0.60 μg / 100 μL APC-H7 konjuge CD8 antikoru, 0.30 μg / 100 μL PE konjuge CD25 antikoru, 5 μL (1: 20) APC konjuge Nrp1 antikoru. Tüpleri buz üzerinde 40 dakika inkübe edin.
- Her tüpe 200 μL FACS tamponu ekleyin. Tüpleri 433 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Bir kez daha tekrarlayın.
- Hücre peletini 500 μL Geçirgenleştirme Fiksasyon Tamponu (PFB) içinde yeniden süspanse ederek hücreleri sabitleyin ve geçirgen hale getirin.
not: PFB, 1 kısım Fiksasyon/Geçirgenleştirme Konsantresi ile 3 kısım Fiksasyon/Geçirgenleştirme Seyrelticisi karıştırılarak hazırlanır.
- Tüpleri gece boyunca buzdolabında 4 °C'de saklayın.
not: 1 saatlik bir inkübasyon da işe yarar.
- Tüpleri 433 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Hücre peletini 500 μL Geçirgenleştirme Yıkama Tamponu (PWB) içinde yeniden süspanse edin. Tüpleri 433 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın.
not: PWB, Geçirgenleştirme Tamponunun (10x) distile suda 1:10 oranında seyreltilmesiyle hazırlanır.
- Hücreleri 100 μL PWB'de aşağıdaki hücre içi antikorlarla boyayın: 0.30 μg / 100 μL PE-Cy7-konjuge Foxp3 antikoru, 4 μL (1: 25) PacificBlue konjuge Helios antikoru. Tüpleri 1 saat buz üzerinde inkübe edin.
- Her tüpe 500 μL PWB ekleyin. Tüpleri 433 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Hücre peletini 500 μL PWB'de yeniden süspanse edin. Tüpleri 433 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Hücre peletini 300 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
- Hücreleri bir akış sitometresinde analiz edin.
- Tek hücreleri Yan Saçılma Alanı, Yükseklik ve Genişlik ve İleri Saçılma Alanı, Yükseklik ve Genişlik'e göre geçirin. Analiz için bir milyon olay çalıştırın.
- Deneylerin FCS dosyalarını dışa aktarın ve akış sitometrisi analizörü yazılımını kullanarak analiz edin.
