Bir Fare Karaciğerinden Marjinal Hepatik Lökositlerin İzolasyonu

Özet

Kaynak: Sorski, L., et al. Marjinasyonlu hepatik Lökositlerin Seçici Hasadı. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu videoda, marjinal hepatik lökositlerin fare karaciğerinden zorla perfüzyon ile izolasyonunu gösteriyoruz.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Fare Protokolü

1. Karaciğer perfüzyonu ve MH-lökositlerin toplanması
   1. Hayvanı% 8 izofluran doz aşımı ile ötenazi yapın. Önlem olarak, göğüs boşluğunu açana kadar farenin başının etrafına izofluran ile ıslatılmış bir ped içeren 15 ml'lik bir tüp yerleştirin.
   2. Farenin uzuvlarını bir yatağa sabitleyin.
   3. Solunumun kesilmesinden hemen sonra karaciğeri ve kardiyopulmoner kompleksi açığa çıkarmak için periton ve göğüs boşluklarını açın, diyaframın alt kısmını sağlam tutun (boşaltılan bir göğüs boşluğu havuzu oluşturmak için). Bu işlem sırasında kanamadan kaçının.
      1. Spesifik olarak, insizyonu iç organlara zarar vermeden alt karın orta hat noktasından başlatın ve her iki tarafa çapraz olarak kaburgalara doğru ilerleyin ve bunları üst göğüs boşluğu seviyelerine kadar kesin.
   4. Bağırsakları dışarı çekin ve portal damarı ortaya çıkarmak için hayvanın dışına, deneycinin sağına yerleştirin.
   5. Peristaltik bir pompaya bağlı 30 g'lık bir iğneyi portal ven rostral içine splenik ven içine yerleştirin.
   6. Perfüzatın göğüs boşluğundan drenajına ve toplanmasına izin vermek için diyaframın üzerindeki inferior vena kava'yı kesin.
   7. Peristaltik pompayı yaklaşık 3 ml / dak hızında açın ve göğüs boşluğu havuzundan kanla kontamine olmuş ilk 3 ml perfüzatı nazikçe toplayın.
   8. Bu perfüzatı atın. Gerekirse, tuzlu su kullanarak böyle bir yıkamayı tekrarlayın ve ancak o zaman karaciğer perfüzatını toplamaya başlayın.
   9. Perfüzyonu 4 ml / dk'ya kadar bir hızda yeniden başlatın ve bir şırıngaya bağlı bir kelebek kullanarak göğüs boşluğundan 10 ml perfüzat toplayın.
   10. Karaciğerin rengi açık kahverengiye döndüğünde perfüzyonu sonlandırın.

2. Lökosit Ekstraksiyonu

1. Perfüzatı 400 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
2. Süpernatanı aspire edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Autoclud Peristaltik pompa
Kelebek iğne	Aman Tanrım		26G (26G)
Kelebek iğne	Aman Tanrım		21G*3/4 inç
şırınga	Pic çözümü		1 ml
şırınga	Pic çözümü		2,5 ml
şırınga	Pic çözümü		5 ml
şırınga	Pic çözümü		10 ml
şırınga	Pic çözümü		25 ml
Körelmiş kenarlı forseps
makas
Kanama durdurucu
Doku forseps