$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Megakaryosit Farklılaşması
- 12 oyuklu bir plakada kuyucuk başına 50 ng / mL rekombinant insan trombopoietini (rhTPO) ile desteklenmiş 2 mL SFM'de 5 ×10 5 hücre / mL CD34 + hücresi. Hücreleri nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C,% 5 CO2'de inkübe edin. Hücreler analiz için gerekmeden önce birleşirse, hücreleri hasat edin ve bunları taze ortam ve rhTPO ile birden fazla kuyuya bölün.
not: Farklı zaman noktalarında (örneğin, 7, 9 ve 10. günler) farklılaşmayı izlemek için iki veya üç kuyu özel olarak hazırlanmalıdır.
- Diğer kuyucuklardaki hücreleri rahatsız etmeden farklılaşmayı izlemek için bir kenara ayrılan kuyulardan hücreleri hasat edin.
- Hücreleri 20 μL anti-GPIIb/CD41-FITC antikoru ve 10 μL anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 antikoru ile 100 μL'lik bir son hacimde boyayın. İlgili izotip kontrol antikorlarını kullanarak bir kontrol tüpü ayarlayın. 4 °C'de 15 - 30 dakika inkübe edin.
- Yıkamak için 1 mL SB ekleyin. 400 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 200 - 300 μL SB içinde yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi ile analiz edin.
- Her florofor için, FITC ve Alexa Flour 647 pozitif popülasyonları için geçitlemeyi ayarlamak üzere izotip kontrollerini analiz edin. Olgun MK'yi temsil eden CD41 + / CD42a + çift pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için lekeli hücre örneklerini analiz edin (Şekil 1C).
- Hücre yüzeyi belirteçlerinin mikroskobik görselleştirilmesi için, hücreleri 1.3'te açıklandığı gibi boyayın.
- Yıkamak için 1 mL SB ekleyin. 400 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Peleti 100 μL SB içinde yeniden süspanse edin ve 5 dakika boyunca 1.000 x g'da bir cam slayt üzerine döndürün. Hücreleri 30 saniye boyunca metanole batırarak slayta sabitleyin. Havayla kurutun, DAPI içeren 20 μL montaj ortamı ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın), bir lamel ile örtün ve bir floresan mikroskobu kullanarak görselleştirin (Şekil 2A).
- Hücre içi antijenlerin görselleştirilmesi için, hücreleri PBS'de yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca paraformaldehit (% 1 nihai konsantrasyon) ile sabitleyin. Hücrelere nüfuz etmek için triton-X 100 (% 0.1) ekleyin ve 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 2 mL PBS /% 0.1 triton-X 100 ile yıkayın. 100 μL PBS /% 0.1 triton-X 100 içinde yeniden süspanse edin, anti-vWf ve anti-CD62p antikorları ekleyin (1:200 seyreltme) ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- 2 mL PBS /% 0.1 triton-X 100 ile yıkayın ve 400 × g'da 10 dakika santrifüjleyin, aynı tamponun 100 μL'sinde yeniden süspanse edin ve anti-fare IgG-Alexa 594 ve anti-tavşan IgG-Alexa 488 ekleyin (1:100). Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, 2 mL PBS /% 0.1 triton-X 100 ile yıkayın, aynı tamponun 100 μL'sinde yeniden süspanse edin ve 20 μL anti-CD42b-APC ekleyin. Daha sonra hücreleri adım 1.6.1'de açıklandığı gibi cam slaytlar üzerine döndürün ve adım 1.6.1'de açıklandığı gibi mikroskobik görselleştirme için örnekler hazırlayın.
- Ploidi tayini için, hücreleri farklılaşmanın 12. veya 13. günlerinde hasat edin. Yıkamak için 1 mL SB ekleyin. 400 × g'da 10 dakika santrifüjleyin ve 100 μL'lik son hacimde 20 μL anti-GPIIb / CD41-FITC antikoru ile boyayın. 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- 1 mL SB ile bir kez yıkayın ve peleti 20 μg / ml propidyum iyodür ve% 0.05 Triton-X 100 içeren 300 μL hipotonik sitrat tamponunda (1.25 mM sodyum sitrat, 2.5 mM sodyum klorür, 3.5 mM dekstroz) yeniden süspanse edin. Işıktan koruyarak 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
- RNase'yi 20 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve ışıktan korunarak 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin. CD41-FITC + popülasyonunun 30.000 ila 50.000 olayını toplayarak akış sitometrisi ile propidyum iyodürün yoğunluğunu belirleyin (Şekil 2C).
2. Proplatelet Sayımı, Trombosit Sayımı ve Trombosit Aktivasyonu
- Farklılaşmanın 8. veya 9. günlerinde hücreleri (adım 1.1'den itibaren) hasat edin ve 50 ng / mL rhTPO ile desteklenmiş 200 μL taze SFM'de 48 oyuklu plakalarda 1 × 104 hücre / kuyuda tohumlayın. 37 ° C'de 5 gün boyunca kültür,% 5 CO2.
not: Kantitasyon amacıyla, üç nüsha halinde tohum kuyuları. Bu düşük yoğunluk, proplatelet taşıyan MK'nin görselleştirilmesi ve sayılması için gereklidir. Proplateletler genellikle kültürden 2 gün sonra ortaya çıkmaya başlar. Zirve 4. ve 5. günler arasındadır.
- 10X veya 20X objektif kullanarak ters çevrilmiş bir ışık mikroskobunda tüm kuyucuktaki proplatelet taşıyan MK sayısını sayın.
not: Isıtılmış (37 °C) bir mikroskop aşaması tercih edilir, çünkü hücreleri uzun süre oda sıcaklığında tutmak proplatelet uzantılarının büzülmesine neden olur. Proplateletler, MK gövdesinden uzun uzantılar olarak gözlenir. Her MK birkaç proplatelet çıkıntısına sahip olabilir. Proplateletler geliştikçe, MK'nin gövdesi boyut olarak küçülür.
- Hücreleri hasat edin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri, adım 1.3 ve 1.4'te açıklandığı gibi 20 μL anti-insan CD41-FITC antikoru ile boyayın. Proplatelet taşıyan MK (pbMK) yüzdesini hesaplayın:
pbMK (%) = [(Proplatelet taşıyan MK'ler/ kuyu) / (Toplam CD41+ hücreler/ kuyu)] x 100
- Kültür ortamına salınan trombositleri saymak için, hücreleri bir Pasteur pipeti ile nazikçe karıştırın ve kültürün 14. veya 15. günlerinde 100 μL toplayın.
- 20 μL anti-insan CD41-FITC antikoru ile 4 ° C'de 20 - 30 dakika boyunca boyayın. İlgili izotip kontrol antikorunu kullanarak bir kontrol tüpü ayarlayın.
- 150 μL SB ve 50 μL sayma boncuğu ekleyin.
- Akış sitometrik analizi için FSC ve SSC'yi günlük ölçeğine ayarlayın. Trombositler için kapıyı ayarlamak için bölüm 2.4.1'de açıklandığı gibi CD41-FITC ile boyanmış trombositten zengin plazmadan normal insan kan trombositlerini kullanın (Şekil 3A).
- Akış sitometrisi ile boncukları sayarak lekeli trombositleri analiz edin. FSC ve SSC dağılım grafiğini kullanarak boncuk sayma olaylarının 1.000'ini toplayın (Şekil 3A). Aşağıdaki formülü kullanarak CD41-FITC pozitif olaylara (Şekil 3B) dayalı trombosit sayısını hesaplayın:
μL başına trombositler=[(CD41-FITC pozitif olay sayısı)/1.000 boncuk)] x [(50 μL'deki boncuk sayısı)/numune hacmi)]
- Trombosit aktivasyonunu analiz etmek için, hücreleri bir Pasteur pipeti ile nazikçe karıştırın ve kültürün 14. veya 15. günlerinde 100 μL toplayın. 1 mL Tiroz tamponu (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 0.2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5.5 mM D-glikoz, pH 6.5) ekleyin ve pelet hücrelerine 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı toplayın ve trombosit büyüklüğündeki partikülleri pelet haline getirmek için 10 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve 100 μL Tyrode tamponunda yeniden süspanse edin. 20 μM'lik bir nihai konsantrasyona 20 μL PAC1-FITC antikoru ve adenozin difosfat (ADP) ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. FITC pozitif olayların yüzdesini belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edin. Pozitif kontrol ile aynı şekilde muamele edilmiş taze insan trombositlerini kullanın (Şekil 3C).
