$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. 3D iTE Oluşturmak için Timik Organ Kültürü
- Fare fetal timik loblarını hasat edin ve deoksiguanozin (dGUO) tedavisi ile endojen lenfositleri dağıtın.
- dGUO tedavisinin 7. gününde, dört yeni 10 cm'lik tabak alın ve her birini 20 mL tam ortamla doldurun (Roswell Park Memorial Institute Media 1640 [RPMI 1640] +% 10 FBS + 1x L-alanil-L-glutamin + 1x sodyum piruvat + 1x esansiyel olmayan amino asitler (MEM-NEAA) + 1x penisilin-streptomisin + [1:1000] 2-merkapto etanol).
- Timik loblu tüm nitroselüloz membranları 10 cm'lik bir tabağa aktarın. Tek tek lobları forseps ile zardan ayırın ve ortama daldırılmalarına izin verin. Membranları atın. RT'de 1 saat inkübe edin.
- Timik lobları tam besiyeri olan 10 cm'lik yeni bir tabağa aktarın ve RT'de 1 saat inkübe edin. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın.
- Forseps kullanarak, timik lobları tabağa sabitleyin (her seferinde bir tane) ve diğer elinizle merkezde 100-200 μm derinliğinde bir kesi yapın ve lob içine T hücresi progenitör göçünü kolaylaştırmak için lobun çapının yarısını uzatın.
- Timik lobları, tam farklılaşma ortamı ile doldurulmuş 10 cm'lik yeni bir tabağa aktarın (tam ortam + 5 ng/mL fare interlökin-7 (IL-7) + 5 ng/mL fare Flt3 ligandı (FLT3L) + 5 ng/mL kök hücre faktörü (SCF)).
- İsteğe bağlı olarak, alt ve üst seviye ızgaralara sahip 3D kültür plakaları kullanılıyorsa, asılı damlaların buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için her iki ızgarayı da steril PBS ile doldurun.
- Adım 1.6'dan bir dGuo ile muamele edilmiş timik lob içeren 30 μL tam ortamı 3D kültür plakasının her bir oyuğuna aktarın.
- OP9 / DLL1 ko-kültüründen (16-21 gün) yapışmamış T soy hücrelerini (iPSC'den türetilmiş olgunlaşmamış T hücreleri) toplayın ve 20 μL ortam başına 2-5 x 103 T soy hücresinde yeniden süspanse edin.
- 3D kültür plakasındaki her timik loba 20 μL T soy hücresi süspansiyonu ekleyin. Gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
- P200 pipetini 30 μL'ye ayarlayın ve timik lobları çevreleyen tüm hücreleri çıkarmak için her bir oyuktan birkaç kez pipetledikten sonra ortamı aspire edin. Ortamı atın ve 30 μL tam ortam ekleyin. Loblara göç etmeyen ekstra olgunlaşmamış T hücrelerini çıkarmak için bu işlemi 5-7 kez tekrarlayın. Bundan sonra her gün 25-30 μL besiyerini değiştirin.
- Işık mikroskobu ile 4-5. günlerden başlayarak lobların etrafında iPSC'den türetilmiş timik göçmenlerin (iTE) bir halesinin oluşumunu onaylayın.
- Lobu bozmadan medyayı pipetleyerek günlük olarak iTE toplayın. Medyayı her gün değiştirin ve yaklaşık 12 güne kadar toplamaya devam edin.
- Hasat edilen iTE, moleküler analizler (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4) veya in vivo transplantasyon deneyleri için kullanıma hazırdır.
