$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Şekil 1'de gösterildiği gibi karaciğer dokularından NK hücre genişlemesi (Gün 0).
NOT: İlk hücre sayısı ve canlılığı, organın çıkarılmasından bu yana geçen süre ve ilk doku örneği miktarı ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bununla birlikte, dokular 30 mL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS) yerleştirilir ve gece boyunca buz üzerinde veya buzdolabında 4 ° C'de tutulursa, NK hücreleri 24 saat sonrasına kadar yüksek saflık ve canlılıkta genişletilebilir.
- Steril cerrahi ekipman kullanarak dokulardan ve kesitlerden lenfositler elde etmek için canlı doku alanlarını belirleyin.
- Dokuları 30 mL HBSS'ye (kalsiyum veya magnezyum olmadan) yerleştirin ve izolasyona hazırlanmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
- Biyogüvenlik kabini içinde steril tıraş bıçağı veya makas ve forseps kullanarak dokuyu <0,5 cm'lik küpler halinde doğrayın.
- HBSS'de (10x Kollajenaz IV: 10 mg / mL veya ~ 200 U / mL) 10x stoğu seyrelterek 1x kollajenaz IV çözeltisi (1 mg / mL) hazırlayın.
- Kıyılmış doku parçalarını doku ayrıştırıcı tüplere yerleştirin. Tüpleri en fazla 4 g doku ile doldurun ve doku parçalarını ~ 10 mL 1x kollajenaz IV'e batırın.
not: DNase I'in kullanılması, NK canlılığını ve verimini biraz azaltabileceğinden önerilmez. Kullanılan spesifik doku ayrıştırıcı tüpler için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.
- Doku ayrıştırıcı tüpleri bir doku ayrıştırıcıya yerleştirin ve dokuyu iyice kıymak için 37 °C'de karıştırın.
not: Karaciğer dokusu için bu 30 dakikadan fazla sürebilir. Daha gevrek doku için yaklaşık 15 dakika yeterli olabilir. Lütfen belirli doku ayrıştırıcı tüpler ve kullanılan doku ayrıştırıcı için Malzeme Tablosuna bakın.
- Doku ayrıştırıcı tüplerini çıkarın ve 5 mL'lik bir şırınganın arka ucunu kullanarak 40 μm'lik bir naylon hücre süzgecinden geçirin. Eluent'i toplayın ve sindirilmemiş büyük parçaları atın.
- Eluenti oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin.
- Aksi takdirde nihai lenfosit fraksiyonunu kirletecek yağ hücrelerini çıkarmak için hücre peletlerini %30 polivinilpirolidon (PVP) kaplı silika içinde yeniden süspanse edin.
- 1x PVP kaplı silika hazırlamak için, 10x PBS'de PVP kaplı silikanın 9:1 seyreltmesini kullanın.
not: Kullanılan özel PVP kaplı silika için Malzeme Tablosuna bakın.
- %30 PVP kaplı silika hazırlamak için 1x PVP kaplı silikayı PBS/HBSS ile seyreltin.
- Hücre peletini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin.
- Hücre peletini 9 mL R-10 ortamında yeniden süspanse edin.
not: R-10 ortamının bileşimi için Malzeme Tablosuna bakın.
- Lenfositleri kırmızı kan hücrelerinden ve polimorfonükleer hücrelerden ayırmak için hücre süspansiyonunu 4 mL Ficoll veya lenfosit ayırma ortamı üzerine dikkatlice katmanlayın.
- Hızlanma ve frenler kapalıyken veya en düşük ayarda oda sıcaklığında 23 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek katmanları ayırın. Üst-orta tabakayı dikkatlice boşaltın ve doku sızan lenfositleri içeren interfazı hasat edin.
- Hücreleri 10 mL medya ile durulayın ve hücre sayımı, akış sitometrisi, hücrelerin alikotasyonu ve dondurulması veya birincil NK genişletme protokolüne devam edin.
