İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Şekil 1'de gösterildiği gibi karaciğer dokularından NK hücre genişlemesi (Gün 0).
NOT: İlk hücre sayısı ve canlılığı, organın çıkarılmasından bu yana geçen süre ve ilk doku örneği miktarı ile güçlü bir şekilde ilişkilidir. Bununla birlikte, dokular 30 mL Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS) yerleştirilir ve gece boyunca buz üzerinde veya buzdolabında 4 ° C'de tutulursa, NK hücreleri 24 saat sonrasına kadar yüksek saflık ve canlılıkta genişletilebilir.
- Steril cerrahi ekipman kullanarak dokulardan ve kesitlerden lenfositler elde etmek için canlı doku alanlarını belirleyin.
- Dokuları 30 mL HBSS'ye (kalsiyum veya magnezyum olmadan) yerleştirin ve izolasyona hazırlanmaya hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
- Biyogüvenlik kabini içinde steril tıraş bıçağı veya makas ve forseps kullanarak dokuyu <0,5 cm'lik küpler halinde doğrayın.
- HBSS'de (10x Kollajenaz IV: 10 mg / mL veya ~ 200 U / mL) 10x stoğu seyrelterek 1x kollajenaz IV çözeltisi (1 mg / mL) hazırlayın.
- Kıyılmış doku parçalarını doku ayrıştırıcı tüplere yerleştirin. Tüpleri en fazla 4 g doku ile doldurun ve doku parçalarını ~ 1 mL 1x kollajenaz IV.
içine daldırın
not: DNase I'in kullanılması, NK canlılığını ve verimini biraz azaltabileceğinden önerilmez. Kullanılan spesifik doku ayrıştırıcı tüpler için lütfen Malzeme Tablosuna bakın.
- Doku ayrıştırıcı tüpleri bir doku ayrıştırıcıya yerleştirin ve dokuyu iyice kıymak için 37 °C'de karıştırın.
not: Karaciğer dokusu için bu 30 dakikadan fazla sürebilir. Daha gevrek doku için yaklaşık 15 dakika yeterli olabilir. Lütfen belirli doku ayrıştırıcı tüpler ve kullanılan doku ayrıştırıcı için Malzeme Tablosuna bakın.
- Doku ayrıştırıcı tüplerini çıkarın ve 5 mL'lik bir şırınganın arka ucunu kullanarak 40 μm'lik bir naylon hücre süzgecinden geçirin. Eluent'i toplayın ve sindirilmemiş büyük parçaları atın.
- Eluenti oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin.
- Aksi takdirde nihai lenfosit fraksiyonunu kirletecek yağ hücrelerini çıkarmak için hücre peletlerini %30 polivinilpirolidon (PVP) kaplı silika içinde yeniden süspanse edin.
- 1x PVP kaplı silika hazırlamak için, 10x PBS'de 9:1 PVP kaplı silika seyreltmesi kullanın.
not: Kullanılan özel PVP kaplı silika için Malzeme Tablosuna bakın.
- %30 PVP kaplı silika hazırlamak için 1x PVP kaplı silikayı PBS/HBSS ile seyreltin.
- Hücre peletini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin.
- Hücre peletini 9 mL R-10 ortamında yeniden süspanse edin.
not: R-10 ortamının bileşimi için Malzeme Tablosuna bakın
- Lenfositleri kırmızı kan hücrelerinden ve polimorfonükleer hücrelerden ayırmak için hücre süspansiyonunu 4 mL Ficoll veya lenfosit ayırma ortamı üzerine dikkatlice katmanlayın.
- Hızlanma ve frenler kapalıyken veya en düşük ayarda oda sıcaklığında 23 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyerek katmanları ayırın. Üst-orta tabakayı dikkatlice boşaltın ve doku sızan lenfositleri içeren interfazı hasat edin.
- Hücreleri 10 mL medya ile durulayın ve hücre sayımı, akış sitometrisi, hücrelerin alikotasyonu ve dondurulması veya birincil NK genişletme protokolüne devam edin.
>2. Şekil 0'de gösterildiği gibi PBMC'lerden (veya CB veya organ dokularından) birincil NK hücre genişlemesi (Gün 2).
- Donmuş PBMC'yi ve donmuş, ışınlanmış besleyici hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda çözün.
- PBMC ve 100 Gama ışınlı (Gy ışınlanmış) 221 mIL-21 hücresini, 10 mL R-10 ortamı ile ayrı ayrı 400 x g'da 5 dakika santrifüjleme ile yıkayın.
- Akış sitometrisi için 1 x 106 hücreli PBMC kaydedin.
not: İlk NK hücre saflığı, NK hücre genişleme hızının hesaplanmasında önemli bir faktördür.
- Hücreleri 1 mL R-10 ortamında yeniden süspanse edin. Tripan Blue kullanarak hücreleri sayın.
- 5 x 106 hücreli PBMC'yi 10 x 106 hücreli 100 Gy ışınlanmış 221-mIL-21 hücreli özel bir 6 oyuklu plakada karıştırın (bkz.
- İnsan IL-2 (200 U/mL) ve insan IL-15 (5 ng/mL) ile takviye edilmiş 30 mL R-10 ortamı ekleyin (bkz.
- Özel 6 oyuklu plakayı 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin.
- NK hücrelerini her 3-4 günde bir korumak için ortamı insan IL-2 (200 U/mL) ve insan IL-15 (5 ng/mL) ile desteklenmiş R-10 ortamıyla değiştirin.
not: Her ortam değişikliğinde daha fazla genişleme için oyuk başına 20 x 106 hücreden daha azını koruyun. En iyi canlılık için, her bir oyuktaki toplam hücre sayısının 100 x 106 hücreyi geçmediğinden emin olun.
- NK hücre genişleme oranını hesaplamak için toplam hücre sayısını, canlılığını kaydedin ve her 3-4 günde bir akış sitometrisi yapın.
