Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Özet

Bir In vitro • hsp 90 protein kompleksleri proteinler ve hücresel lizatları saflaştırılmış fonksiyonel glukokortikoid reseptör (GR) hazırlanması için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, tuz sıyırma ve protein kompleksi sulandırıldıktan takip rekombinant GR immunoadsorption kullanır. Potansiyel yöntemi uygulamaları gibi kofaktör ve tampon koşulları önemi tartışıldı.

Özet

Hsp90 önemli ve son derece bol moleküler şaperon protein, hücre bisiklet alan transkripsiyon faktörleri (örneğin nükleer reseptörleri, p53) ve protein kinazlar (örneğin, Src, Raf, Akt kinaz) dahil olmak üzere 150'den fazla ökaryotik sinyalizasyon proteinler, düzenleyen tespit edilmiştir. tümörogenez, apoptozis ve birden fazla ökaryotik sinyalizasyon ^yolları 1,2 . Hsp 90 için bu çok 'yandaş' proteinler ki, steroid reseptör montaj • hsp 90 kompleksleri (Şekil 1) en iyi tanımlanmış . Biz burada bir uyarlanabilir glukokortikoid reseptör (GR) immunoprecipitation tahlil ve ökaryotik hsp 90 fonksiyonel aktivite, bağlayıcı hsp 90-aracılı steroid reseptör ligand ve moleküler şaperon kofaktör gereksinimleri kolayca prob kullanılıyor olabilir • in vitro GR hsp 90 sulandırıldıktan yöntemi mevcut. Örneğin, bu testte hsp 90 kofaktör gereksinimleri ve eksojen bileşiklerin sulandırıldıktan süreci ekleyerek etkilerini test etmek için kullanılır.

Reseptör steroid ³ erişilebilir yarık açık bir ligand bağlanması için hsp 90 bağlı olması gerekir, çünkü GR hsp 90 eğitim için özellikle yararlı bir sistem olmuştur . Endojen, unliganded GR noncovalently hsp 90 bağlı memeli hücrelerinin sitoplazmasında bulunur. Endojen GR • hsp 90 heterocomplex bulunan yarık GR ligand bağlanması, açık ve bağlayıcı steroid yeteneğine sahip. Hsp 90 GR ayrıdır veya onun işlevini inhibe ise, alıcı, steroid bağlamak mümkün ve steroid bağlanma aktivitesi önce GR • hsp 90 heterocomplex sulandırılması ^gereklidir 4 geri . GR bir monoklonal antikor kullanılarak hücre sitoplazmada immunoprecipitated ve western blot ile test edilebilir gibi hsp 90 proteinler GR için complexed olabilir. ^[3 H] steroid immunopellet kuluçka immunoprecipitated GR Steroid bağlayıcı aktivite tespit edilebilir.

Önceki deneyler, yarık GR ligand bağlama hsp 90 aracılı açılış göstermiştir hsp70, ikinci bir moleküler şaperon ökaryotik hücre canlılığı için de gereklidir gerektirir. Hsp 90 ve hsp70 biyokimyasal faaliyet proteinler co-hastabakıcı Hop hsp40 ve P23 ⁵ tarafından katalize. Multiprotein hastabakıcı makineleri hsp 90, hsp70, Hop, ve hsp40 içeren bir ökaryotik hücre sitoplazmasında endojen ve retikülosit lizat bir hastabakıcı zengin protein kaynağı ⁶ sağlar.

Sunulan yöntem, GR hücre sitoplazmada immunoadsorbed ve hafif tuzlu koşulları kullanarak endojen hsp90/hsp70 şaperon makine elimden. Tuz elimden GR GR sulandırıldıktan sonuçları retikülosit lizat, ATP ve K ⁺ ile inkübe steroid bağlanma aktivitesi ⁷ • hsp 90 heterocomplex ve yeniden. Bu yöntem, hsp 90-aracılı steroid ^bağlayıcı 8-11 fonksiyonel önemi belirlemek amacıyla çeşitli şaperon kofaktör, roman proteinleri, ve deneysel hsp 90 GR inhibitörlerinin etkilerini test etmek için kullanılabilir .

Protokol

1. Fonksiyonel GR bulunduğu hücrenin sitoplazmada hazırlanması

1. Teknik not: Tüm tamponlar soğutmalı olmalı ve santrüfüj ve inkübasyon dahil olmak üzere bu protokolü, her adımında, buz üzerinde veya 4 yapılmalıdır ° C, aksi belirtilmedikçe. Düşük sıcaklık, GR ve protein kompleksleri bozulmasını önlemek için çok önemlidir.
2. Soğutmalı santrifüj kullanarak hücrelerin fonksiyonel GR yüksek bir konsantrasyon ifade ~ 1-5 ml pelet edinin. GR zengin hücre kaynakları örnekleri fare fibroblast endojen GR yüksek bir konsantrasyon ifade L929 hücreleri, ve Sf9 rekombinant GR bakülovirüs (örneğin p2Bac-mgr bakülovirüs ¹²⁾ ile enfekte olmuş hücreleri iç....

Tartışma

Yukarıda açıklanan test hsp90/hsp70-based hastabakıcı makineleri şaperon yanı sıra eylemlerin GR steroid bağlanma etkileyen şartlar sayısız test etmek için adapte edilebilir. Bu, daha önce bildirilen ^yöntemler 4,8,9,17 bir değişiklik ve elektroforez teknolojisi son gelişmeler yararlanmak ve daha geniş bir araştırma topluluğu erişilebilir olması için tasarlanmıştır . Ek ilgi kofaktör veya protein GR eklenebilir steroid bağlayıcı, heterocomplex protein-protein etkileşimleri ve co-faktör gereksinimleri üzerine e.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sf9 böcek hücre	Invitrogen		rekombinant fare GR bakülovirüs ifade
L929 hücreleri	ATCC	CRL-2173	endojen fare GR sitoplazmada hazırlanması (bakülovirüs ifade alternatif)
FiGR hibridoma hücreleri	ATCC	CRL-2173	anti-GR monoklonal antikor içeren asit (saflaştırılmış BuGR2 antikor alternatif) hazırlamak için
Komple-Mini proteaz inhibitörü, EDTA-free	Roche Uygulamalı Bilimler	11836170001
protein A-sepharose	Sigma-Aldrich	P3391
tavşan retikülosit lizat	Yeşil Hektar (Oregon, WI)		endojen hsp90/hsp70 hastabakıcı makineleri zengin bir kaynak
kreatin fosfokinaz	Sigma-Aldrich	C3755	ATP-yenileyici sistem
phosphocreatine	Sigma-Aldrich	P7936	ATP-yenileyici sistem
anti-GR fare monoklonal antikor (BuGR2)	Pierce / Thermo Scientific	MA1-510	GR immunoadsorption için kullanılan ve batı blot olarak primer antikor
anti-hsp 90 fare monoklonal antikor (AC88)	Enzo Yaşam Bilimleri	ADI-SPA-830	western blot primer antikor olarak kullanılan
hsp70 anti-fare monoklonal antikor (N27F3 4)	Enzo Yaşam Bilimleri	ADI-SPA-820	western blot primer antikor olarak kullanılan
Fare serumu ile IgG	Sigma-Aldrich	038K7690	immün olmayan antikor immunoadsorption negatif kontrol olarak kullanılan
anti-fare IgG-peroksidaz konjuge	Sigma-Aldrich	A4416	western blot ikincil antikor olarak kullanılan
Experion mikroakışkan elektroforez sistemi	Bio-Rad	7007001	geleneksel SDS-PAGE alternatif
[1,2,4,6,7 - 3 H] deksametazon	Perkin Elmer	NET1192001MC	güvenlik önlemlerini izleyin