Yöntem makalesi

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

14.5K görüntüleme

DOI:

10.3791/3059

21 Eylül 2011

Bu makalede

Özet

Bir In vitro • hsp 90 protein kompleksleri proteinler ve hücresel lizatları saflaştırılmış fonksiyonel glukokortikoid reseptör (GR) hazırlanması için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, tuz sıyırma ve protein kompleksi sulandırıldıktan takip rekombinant GR immunoadsorption kullanır. Potansiyel yöntemi uygulamaları gibi kofaktör ve tampon koşulları önemi tartışıldı.

Özet

Hsp90 önemli ve son derece bol moleküler şaperon protein, hücre bisiklet alan transkripsiyon faktörleri (örneğin nükleer reseptörleri, p53) ve protein kinazlar (örneğin, Src, Raf, Akt kinaz) dahil olmak üzere 150'den fazla ökaryotik sinyalizasyon proteinler, düzenleyen tespit edilmiştir. tümörogenez, apoptozis ve birden fazla ökaryotik sinyalizasyon yolları 1,2 . Hsp 90 için bu çok 'yandaş' proteinler ki, steroid reseptör montaj • hsp 90 kompleksleri (Şekil 1) en iyi tanımlanmış . Biz burada bir uyarlanabilir glukokortikoid reseptör (GR) immunoprecipitation tahlil ve ökaryotik hsp 90 fonksiyonel aktivite, bağlayıcı hsp 90-aracılı steroid reseptör ligand ve moleküler şaperon kofaktör gereksinimleri kolayca prob kullanılıyor olabilir • in vitro GR hsp 90 sulandırıldıktan yöntemi mevcut. Örneğin, bu testte hsp 90 kofaktör gereksinimleri ve eksojen bileşiklerin sulandırıldıktan süreci ekleyerek etkilerini test etmek için kullanılır.

Reseptör steroid 3 erişilebilir yarık açık bir ligand bağlanması için hsp 90 bağlı olması gerekir, çünkü GR hsp 90 eğitim için özellikle yararlı bir sistem olmuştur . Endojen, unliganded GR noncovalently hsp 90 bağlı memeli hücrelerinin sitoplazmasında bulunur. Endojen GR • hsp 90 heterocomplex bulunan yarık GR ligand bağlanması, açık ve bağlayıcı steroid yeteneğine sahip. Hsp 90 GR ayrıdır veya onun işlevini inhibe ise, alıcı, steroid bağlamak mümkün ve steroid bağlanma aktivitesi önce GR • hsp 90 heterocomplex sulandırılması gereklidir 4 geri . GR bir monoklonal antikor kullanılarak hücre sitoplazmada immunoprecipitated ve western blot ile test edilebilir gibi hsp 90 proteinler GR için complexed olabilir. [3 H] steroid immunopellet kuluçka immunoprecipitated GR Steroid bağlayıcı aktivite tespit edilebilir.

Önceki deneyler, yarık GR ligand bağlama hsp 90 aracılı açılış göstermiştir hsp70, ikinci bir moleküler şaperon ökaryotik hücre canlılığı için de gereklidir gerektirir. Hsp 90 ve hsp70 biyokimyasal faaliyet proteinler co-hastabakıcı Hop hsp40 ve P23 5 tarafından katalize. Multiprotein hastabakıcı makineleri hsp 90, hsp70, Hop, ve hsp40 içeren bir ökaryotik hücre sitoplazmasında endojen ve retikülosit lizat bir hastabakıcı zengin protein kaynağı 6 sağlar.

Sunulan yöntem, GR hücre sitoplazmada immunoadsorbed ve hafif tuzlu koşulları kullanarak endojen hsp90/hsp70 şaperon makine elimden. Tuz elimden GR GR sulandırıldıktan sonuçları retikülosit lizat, ATP ve K + ile inkübe steroid bağlanma aktivitesi 7 • hsp 90 heterocomplex ve yeniden. Bu yöntem, hsp 90-aracılı steroid bağlayıcı 8-11 fonksiyonel önemi belirlemek amacıyla çeşitli şaperon kofaktör, roman proteinleri, ve deneysel hsp 90 GR inhibitörlerinin etkilerini test etmek için kullanılabilir .

Protokol

1. Fonksiyonel GR bulunduğu hücrenin sitoplazmada hazırlanması

  1. Teknik not: Tüm tamponlar soğutmalı olmalı ve santrüfüj ve inkübasyon dahil olmak üzere bu protokolü, her adımında, buz üzerinde veya 4 yapılmalıdır ° C, aksi belirtilmedikçe. Düşük sıcaklık, GR ve protein kompleksleri bozulmasını önlemek için çok önemlidir.
  2. Soğutmalı santrifüj kullanarak hücrelerin fonksiyonel GR yüksek bir konsantrasyon ifade ~ 1-5 ml pelet edinin. GR zengin hücre kaynakları örnekleri fare fibroblast endojen GR yüksek bir konsantrasyon ifade L929 hücreleri, ve Sf9 rekombinant GR bakülovirüs (örneğin p2Bac-mgr bakülovirüs 12) ile enfekte olmuş hücreleri iç....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yukarıda açıklanan test hsp90/hsp70-based hastabakıcı makineleri şaperon yanı sıra eylemlerin GR steroid bağlanma etkileyen şartlar sayısız test etmek için adapte edilebilir. Bu, daha önce bildirilen yöntemler 4,8,9,17 bir değişiklik ve elektroforez teknolojisi son gelişmeler yararlanmak ve daha geniş bir araştırma topluluğu erişilebilir olması için tasarlanmıştır . Ek ilgi kofaktör veya protein GR eklenebilir steroid bağlayıcı, heterocomplex protein-protein etkileşimleri ve co-faktör gereksinimleri üzerine e.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Elektroforez reaktifler seçin ve görüntü analiz yazılımı, Bio-Rad tarafından sağlanmıştır.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık hibe GM086822, Umut Kalp Enstitüsü Temel Bilimler ödül, ve MJ Murdock Hayırsever Güven Koleji Bilim Araştırma Programı Enstitüleri tarafından finanse edildi. Elektroforez reaktifler seçin ve görüntü analiz yazılımı, Bio-Rad tarafından cömertçe verilmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifin Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
Sf9 böcek hücre Invitrogen rekombinant fare GR bakülovirüs ifade
L929 hücreleri ATCC CRL-2173 endojen fare GR sitoplazmada hazırlanması (bakülovirüs ifade alternatif)
FiGR hibridoma hücreleri ATCC CRL-2173 anti-GR monoklonal antikor içeren asit (saflaştırılmış BuGR2 antikor alternatif) hazırlamak için
Komple-Mini proteaz inhibitörü, EDTA-free Roche Uygulamalı Bilimler 11836170001
protein A-sepharose Sigma-Aldrich P3391
tavşan retikülosit lizat Yeşil Hektar (Oregon, WI) endojen hsp90/hsp70 hastabakıcı makineleri zengin bir kaynak
kreatin fosfokinaz Sigma-Aldrich C3755 ATP-yenileyici sistem
phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936 ATP-yenileyici sistem
anti-GR fare monoklonal antikor (BuGR2) Pierce / Thermo Scientific MA1-510 GR immunoadsorption için kullanılan ve batı blot olarak primer antikor
anti-hsp 90 fare monoklonal antikor (AC88) Enzo Yaşam Bilimleri ADI-SPA-830 western blot primer antikor olarak kullanılan
hsp70 anti-fare monoklonal antikor (N27F3 4) Enzo Yaşam Bilimleri ADI-SPA-820 western blot primer antikor olarak kullanılan
Fare serumu ile IgG Sigma-Aldrich 038K7690 immün olmayan antikor immunoadsorption negatif kontrol olarak kullanılan
anti-fare IgG-peroksidaz konjuge Sigma-Aldrich A4416 western blot ikincil antikor olarak kullanılan
Experion mikroakışkan elektroforez sistemi Bio-Rad 7007001 geleneksel SDS-PAGE alternatif
[1,2,4,6,7 - 3 H] deksametazon Perkin Elmer NET1192001MC güvenlik önlemlerini izleyin

Kaynaklar

  1. Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
  2. Murphy, P. J. M.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Glukokortikoid Resept rHsp90 KompleksiSteroid Ba lama Aktivitesimm nopresipitasyon AnaliziRetik losit LizatWestern Blot AnaliziSDS Page ElektroforeziRadyoaktif Ligand Ba lanmasaperon Kofakt r Gereksinimleri

İlgili makaleler