$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Raji Hücrelerini Yapıştırmak için Slaytların Hazırlanması
- 150 μL fibronektin (100 μg / mL) 8 mikro kuyu hazneli bir slayta (plastik tabanlı hazne slaytı) ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika ila 1 saat inkübe edin. Bu yapışma substratı, Raji hücrelerinin kuyu dibine bağlanmasına (Adım 2), Jurkat hücreleri (Adım 4) hücreleri ile canlı konjugatların oluşumuna ve hızlandırılmış mikroskopi yakalamaya (adım 6) izin verecektir ve daha sonra isteğe bağlı paraformaldehit (PFA) fiksasyonu ile uyumludur.
NOT: Aseton fiksasyonu için, aseton plastiği çözdüğü için fibronektin yerine cam alt hazne kızakları ve poli-L-lizin (20 μg/mL) kullanın. 8 mikro kuyu hazneli lam (1 cm2 kuyulu, maksimum 300 μL hacim) veya eşdeğeri esnek ve uygun bir formattır.
- 200 μL'lik otomatik pipet kullanarak fibronektini aspire edin ve her bir kuyuyu 200 μL PBS ile 2 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın. Bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Hazne sürgüsü bu aşamada PBS ile 4 °C'de 1-2 hafta saklanabilir.
2. Raji Hücrelerinin Oda Slaytlarına Yapışması ve 7-amino-4-klorometilkumarin (CMAC) Etiketlemesi
- Raji hücrelerinin 10 mL birleşik (1-2 x 106 hücre / mL) ön kültürünü 15 mL, V-tabanlı bir tüpe aktarın. İyice karıştırın ve Neubauer haznesi veya eşdeğeri üzerindeki hücreleri saymak için 10 μL kullanın.
- Kalan hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve atın.
- Hücre peletini ılık bir tam kültür ortamında (% 10 FCS, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640) 106 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda nazikçe yeniden süspanse edin. Aşağıda verilen denklemi kullanın:
([ ]başlangıç x Vbaşlangıç = [ ]final x Vfinal), burada [ ]başlangıç başlangıç hücre konsantrasyonunu temsil eder, Vbaşlangıç = hücre süspansiyonunun başlangıç hacmi, [ ]final = son hücre konsantrasyonu, Vfinal = hücre süspansiyonunun son hacmi.
NOT: Başlangıç kültürünün hücre konsantrasyonuna bağlı olarak, gerekenden daha fazla hücre toplamak mümkündür, ancak olası sorunları önlemek için kalan hücrelerin deneyin sonuna kadar kültürde (37 °C) tutulması önemlidir (bakınız Adım 2.6).
- Sinaptik konjugat oluşumu sırasında tanımlanmalarına izin vermek için Raji hücrelerini etiketleyin. Bu deneyde, adım 2.4.2'de 7-amino-4-klorometilkumarin (CMAC) etiketlemesi yapılmaktadır.
- Kültür ortamındaki gerekli sayıda Raji hücresini 2 mL'lik bir tüpe aktarın. 8 mikro kuyu odası slaytı için toplam 1.6 mL hücre süspansiyonu gereklidir (oyuk başına 200 μL).
- CMAC'ı 10 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. CMAC ışığa duyarlı olduğu için tüpü alüminyum folyo ile kaplayarak hücreleri karanlıkta tutun. 1 cm2 kuyucuk başına 2 x 105 Raji hücresi içeren 200 μL'ye ihtiyaç vardır. Bu nedenle, 8 kuyu hazırlanması gerekiyorsa, 1.6 x 106 Raji hücresi gereklidir.
NOT: Raji hücrelerini hücre izleyici mavisi (CMAC, UV uyarımı ve mavi emisyon) ile etiketlemek, sinaptik konjugatlar oluştuğunda onları Th hücrelerinden ayırır. Bu boya, PFA ve aseton fiksatifleri ile uyumludur ve daha fazla immünofloresan prosedürlerine izin verir. Hafif teşhirden kaçınmaya çalışın. Raji hücrelerinin CMAC ile bir havuzda etiketlenmesi ve ardından Raji hücrelerinin fibronektin kaplı oda kızaklarına yapışmasından önce yeniden süspansiyon, Raji hücrelerinin CMAC ile farklı kuyucuklar arasında homojen bir şekilde etiketlenmesini sağlar.
- CMAC ile boyanmış hücreleri yeniden askıya alın ve PBS'nin adım 1.2'den oda slaytında aspire edilmesinden sonra, 200 μL hücre süspansiyonunu, adım 1.1-1.2'de hazırlanan fibronektin kaplı oda slaytlarının her bir oyuğuna aktarın. Hazne slaytını 37 ° C,% 5 CO2'de 30 dk-1 saat inkübe edin.
NOT: Yapışma ve CMAC etiketlemesi bu adımda aynı anda gerçekleşir ve bu zaman kazandırır. Raji hücrelerinin hızlı bir şekilde çökeleceğini ve tohumlamadan önce hücre süspansiyonunda homojen bir konsantrasyonu korumak için dikkatli olunması gerektiğini lütfen unutmayın. Bu aşamada CMAC'ın santrifüjleme ile yıkanması gerekli değildir, çünkü CMAC yıkaması adım 2.7'de (etiketli Raji hücreleri hazne kızaklarına zaten yapıştığında) daha kolay yapılacaktır. CMAC, hücre süspansiyonunda büyük miktarda bulunduğundan, mavi floresan arka planı, mavi lekeli hücreleri ayırt etmek için çok yüksektir. CMAC yıkamadan sonra adım 2.7'de hücre CMAC floresansını kontrol edin.
- Mikroskop üzerinde hazne kızaklarını hafifçe sallayarak Raji hücrelerinin kuyucukların dibine yapıştığından emin olun. Hücrelerin birbirleri arasında boşluklar gösterdiğinden ve birleşik olmadığından emin olun (Şekil 1, orta panel). Hücre birleşmesinin% 50-60'ı uygundur.
- Hücrelerin çoğu hazne kızağına verimli bir şekilde yapışırsa ve hücre boşluğu gözlenmezse, her bir kuyuyu ılık tam bir ortamla yıkayın ve hücre fazlalığını ayırmak için ortamı 200 μL'lik bir otomatik pipetle yeniden süspanse edin. Her yeniden askıya alma adımından sonra birleşmeyi kontrol edin.
- Hücreler yapışmazsa, yapışma adımını tekrarlayın ve yapışma süresini ve / veya hücre sayısını artırın.
NOT: Burada durmak, hazne slaytını gece boyunca 37 °C, %5CO2'de (O/N) inkübe etmek ve ertesi gün protokole devam etmek mümkündür. Lütfen ertesi gün floresan mikroskobu kullanarak Raji hücrelerinin yapışmış ve CMAC etiketli kaldığını onaylayın.
- Fazla CMAC'ı ortadan kaldırmak için her bir kuyuyu ılık takviyeli RPMI ile dikkatlice tekrar yıkayın ve floresan mikroskobu ile mavi emisyonu kontrol edin (Şekil 1).
NOT: Daldırma yağı (yapışkan ve viskoz) ve yüksek sayısal açıklıklı yağ hedeflerinin kullanılmasını önlemek için, floresan mikroskobu kullanarak CMAC etiketlemesini hızlı bir şekilde kontrol etmek için ekstra uzun mesafeli (yani 20x veya 40x) objektifler kullanılabilir.
3. CMAC'ın Nabzı — Stafilokokal Enterotoksin E ile Etiketli Raji Hücreleri
- Her oyuğa Staphylococcal Enterotoxin E (SEE, 1 μg/mL) ekleyin. SEE, SEE donmuş stoklarından (PBS'de 1 mg/mL) bir hücre kültürü ortamında (100 μg/mL'de çalışma çözeltisi) uygun şekilde seyreltilebilir. 200 μL mikro kuyucuk başına 2 μL 100x çalışma solüsyonu kullanın.
DİKKAT: Bu adım için eldiven kullanın ve kullanılmış ucu biyolojik tehlike kutusuna atın.
- Hazne slaytını 37 °C, %5 CO2'de en az 30 dakika inkübe edin. SEE etkisi en az 3-4 saat sürer.
NOT: Farklı zaman atlamalı kurulumlar planlanıyorsa (adım 5) ve/veya bitiş noktası deneyleri için başlangıç zaman noktasına bağlı olarak (adım 6) gerektiğinde kuyucuklara farklı zaman noktalarında SEE eklenebilir.
>4. Jurkat Hücrelerinin Hazırlanması
- Bu deney için daha önce büyüyen bir Jurkat hücresi kültürü (1-2 x 106 hücre / mL) kullanın. Daha önce tarif edildiği gibi standart bir kültür şişesinden veya standart elektroporasyon protokollerini takip eden önceki bir transfeksiyondan hücreler kullanın. Jurkat hücrelerinin transfeksiyonu, canlı hücrelerdeki salgı granüllerinin trafiğinin hızlandırılmış görselleştirilmesine izin verecektir. Örneğin, GFP-CD63 (MVB'nin bir belirteci) ifade edildiğinde, GFP-CD63 ile süslenmiş veziküllerin hareketi kaydedilebilir.
- Hücreleri bir faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin. Fazla ölü hücre (% >20-30) gözlenirse, kullanmadan önce ölü hücrelerin fazlalığını ortadan kaldırmak için (ölü hücreler canlı hücrelerden daha yüksek yoğunluk sergiler) standart protokolleri kullanarak Ficoll yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yapın (bkz. Tartışma).
- Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe, V-tabanlı tüpe aktarın ve bir hemositometre kullanarak saymak için 10 μL kullanın.
- Kalan hücreleri adım 2.2'de açıklandığı gibi santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri taze, ılık bir kültür ortamı kullanarak Raji hücreleriyle aynı konsantrasyonda (1 x 106 / mL) yeniden süspanse edin. 2.2-2.3 adımlarını izleyin.
- Adım 4.
'yi beklerken Jurkat hücrelerini kültürde (37 ° C,% 5 CO2) tutun
NOT: İkinci seçenekte (transfeksiyon), canlı hücre sayısı ilkinden çok daha düşük olacaktır. Bu nedenle, deney için yeterli hücreye sahip olmak için daha yüksek bir başlangıç hücre kültürü hacmi kullanmayı düşünün. Elektroporasyon küveti ve transfeksiyon başına 10 x 106 Jurkat hücresinden, 48 saatlik transfeksiyondan sonra sadece 2-4 x 106 Jurkat hücresi hayatta kalacak ve bu hücrelerin bir kısmı Ficoll adımı sırasında kaybolacaktır. Bu nedenle, bir elektroporasyon küveti, 8 mikrokuyudan (1.6 x 106 transfekte edilmiş Jurkat hücresi gereklidir) yapışmış SEE darbeli Raji hücrelerine meydan okumak için genellikle yeterlidir.
5. Raji ve Jurkat Hücrelerinin Birlikte Tohumlanması
- CMAC etiketli, SEE darbeli, yapıştırılmış Raji hücrelerini içeren hazne slaytlarını adım 3.2'den itibaren inkübatörden çıkarın. Bu aşamada CMAC'ı yıkamak gerekli değildir, çünkü bu daha önce Adım 2.7'de yapılmıştır.
- Otomatik 200 μL'lik bir pipet kullanarak her bir oyuğun kültür ortamını kuyunun bir köşesinden birer birer dikkatlice aspire edin. Kuyudaki ortamın tamamen kurumasına izin vermeyin.
- Ortamı, adım 4.5'te hazırlanan hücre kültürü ortamında (1 x 106 / mL) hemen 200 μL yeniden süspanse edilmiş Jurkat hücresi ile değiştirin. Hızlandırılmış görüntüleme yapılırsa, bu adımdan hemen sonra 6. adıma geçin, çünkü Jurkat hücreleri çok hızlı bir şekilde çökelme ve sinaptik konjugatlar oluşturma eğilimindedir. Kolaylık sağlamak için, bu aşamada Jurkat hücreleri ile tohumlama almayan SEE darbeli, yapışmış Raji hücreleri içeren mikro kuyular, Jurkat hücreleri ile daha sonraki mücadeleye kadar bir hücre kültürü ortamı ile korunmalıdır. Bu, ek hızlandırılmış veya ters kinetik, uç nokta deneysel yaklaşımlar için Jurkat hücreleriyle müteakip zorluklara esnek bir şekilde izin verecektir.
- Hızlandırılmış çekim yapılacaksa, hızlı bir şekilde 6. adıma geçin. Bu, sinaptik eşlenik oluşumuna ve eşzamanlı görüntü elde edilmesine izin vermek için mikroskop aşaması inkübatöründe veya 37 ° C'de% 5 CO2'de eşdeğerinde 1-2 saat boyunca ko-kültürü içerir. Son nokta analizi, ancak hızlandırılmış bir analiz öngörülüyorsa, hücreleri sabitlemeden önce mikroskop kullanarak (Şekil 1'deki gibi) ko-kültür döneminden sonra eşlenik oluşumunu kontrol edin.
6. Ortaya Çıkan Sinaptik Konjugatların Hızlandırılmış Görüntülenmesi
- Görüntülemeden önce mikroskobu ve inkübasyon odasını hazırlayın. Örneğin, ayrıntılı mikroskopi ayarları Şekil 2.
'de gösterilmiştir.
NOT: Hızlandırılmış bir deney planlanıyorsa, tüm mikroskop ayarları ve tamamlayıcıları (ortam hücre kültürü odası, vb.), Jurkat süspansiyonunu yapıştırılmış Raji hücreleri ile oda slaydına eklemeden önce hazırlanmalıdır. Ticari bir mikroskop için aşağıdaki adımlar açıklanmıştır (Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, bir hücre kültürü inkübatörü ile donatılmış herhangi bir ters floresan mikroskobu kullanılabilir.
- Polarize trafiği görüntülerken 60x yağa daldırmalı ve yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip bir mikroskop kullanın.
- Otomatik odaklama sisteminin açık olduğundan emin olun ve alt yüzeye bağlı Raji hücrelerini odaklamak için ofseti ayarlayın. Lütfen Şekil 1'e bakın.
- Adım 5.3'te yapıştırılmış Raji hücrelerini içeren her bir oyuğa Jurkat eklendikten sonra, önceden ısıtılmış (1-2 saat) mikroskop aşaması inkübatöründe (yani, OKOlab) mikro kuyu odası slaytını hızlı bir şekilde bulun ve mikroskopla bazı XY pozisyonlarını seçin, örneğin, mikroskop odağına düşen Jurkat ile transfekte edilmiş bir hücre tarafından yapılan ortaya çıkan bir IS oluşumunu kaydetmesi muhtemel alanlar.
- Önceden ısıtılmış bir mikroskop aşaması inkübatörü kullanın, çünkü sıcaklıkta stabilize edilmiş bir aşamanın sabit X, Y, Z pozisyonlarını koruduğu gözlemlenmiştir. Uygun bir XY alanı için kriterler şunlardır: iyi odaklanmış ve birleşmeyen Raji hücreleri (yani, hücreler arasındaki boşlukları gösterme) ve transfekte edilmiş Jurkat hücrelerinin varlığı (bu, geçirgenlik ve UV veya GFP kanallarının birleştirilmesiyle kontrol edilebilir). Jurkat hücreleri, oda slaytı üzerinde çok hızlı bir şekilde (birkaç dakika) çökelecek ve ortaya çıkan sinapsları görüntüleme şansı zamanla azalacaktır (Şekil 1). Tanımlanan hızlandırılmış çekimden sonra deneyi bitirmek veya Adım 7'ye geçmek ve sonraki immünofloresan ve analizler için konjugatları sabitlemek mümkündür.
NOT: Uygun zamansal çözünürlükle (çerçeve başına 1-2 dakika) eşzamanlı, çok kuyulu hızlandırılmış çekim için 4 farklı mikro kuyudan 16'ya kadar farklı mikroskop alanı seçmek mümkündür. Sınırlama, görüntülenecek çeşitli florokromların hem sayısına hem de yoğunluğuna (kamera pozlamasını etkileyen) dayanır (CMAC dışında ifade edilen floresan proteinlerin sayısına bağlı olarak). Kare hızını artırmanın bir yolu, GFP için her "n" zaman diliminden yalnızca birinde CMAC kanalı için kayıt yapmaktır (yani, Şekil 2'de gösterildiği gibi n = 8), çünkü Raji hücreleri kuyu dibine yapışır ve Jurkat hücreleri olarak kolayca hareket etmez. Ek olarak, bu, hücre canlılığına fayda sağlar, çünkü sık UV ışığına maruz kalmak hücrelere zarar verebilir. MVB'nin polarizasyonunun tamamlanması birkaç dakika ila saat sürdüğünden, zaman çerçevesi hızını her 1 dakikada bir veya daha kısa sürede 1 kareye (yani, kare başına 20 s, Şekil 2) ayarlamaya çalışın. Bu çok kanallı yakalamayı gerçekleştirmek için motorlu bir epi-floresan taret ve uygun bant geçiren floresan filtreleri veya eşdeğerleri ile donatılmış bir mikroskop gereklidir.
