Akış Sitometrisi ile İnsan Sitokin ile İndüklenen Öldürücü Hücrelerin CD İşaretleyici Tanıması

Özet

Kaynak: Hsiao, C. H., et al. Kanser Tedavisi için Sitotoksik Sitokin ile İndüklenen Öldürücü T Hücrelerinin İzolasyonu ve Genişletilmesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, periferik kan mononükleer hücre kültüründen genişletilen sitokin kaynaklı öldürücü T hücrelerinin, CIK hücrelerinin oranını belirlemek için akış sitometrisine dayalı bir teknik gösteriyoruz.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. CIK indüksiyonu ve genişlemesi

1. 0. Günde, PBMC'leri (1 x 10⁶), 37 ° C ve% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat boyunca 1.000 IU / mL IFN-γ içeren taze bazal ortamda kültürleyin.
2. 1. Günde, ortamı 50 ng / mL anti-CD3 antikoru, 1 ng / mL rh IL-1α ve 1.000 U / mL rh IL-2 içeren taze bazal ortam ile yenileyin. Ortamı her 3 günde bir yenileyin.
3. 7. Günde, ortamı 1.000 U / mL rh IL-2 içeren taze bazal ortam ile yenileyin. Hücre genişlemesinin sonuna kadar (14. gün) ortamı her 3 günde bir yenileyin.

2. CIK hücrelerinin değerlendirilmesi için immünofenotipleme

1. CIK hücrelerini 10 mL steril PBS ile yıkayın. 300 x g ve 18-20 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 10 mL PBS ile yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlama testini kullanarak hücre sayısını sayın ve hücre canlılığını test edin.
2. CIK hücrelerini ~ 5-10 x 10⁵ hücre / mL PBS yoğunluğunda altı steril 1.5 mL tüpe ayırın. Aşağıdaki gibi etiketleyin ve tedavi edin: Tüp 1, Boş (antikor yok); Tüp 2, 20 μL izotip IgG1-FITC ekleyin; Tüp 3, 20 μL izotip IgG1-APC mAbs ekleyin; Tüp 4, 20 μL CD3-FITC ekleyin; Tüp 5, 20 μL CD56-APC mAbs ekleyin; ve Tüp 6, 20 μL CD3-FITC ve 20 μL CD56-APC mAbs ekleyin.
3. CIK hücrelerini 1 mL steril pipetle en az 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek antikorlarla nazikçe karıştırın ve ardından karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
4. Tüpleri 300 x g ve 18−20 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 1 mL PBS ile bir kez askıya alın. 3 mL steril pipetle en az 1 kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
5. Adım 2.4'ü tekrarlayın.
6. Akış sitometrik analizinden önce tüpleri karanlıkta bırakın.

3. CD işaretleyici tanıma

1. Hücre süspansiyonunu, kapaktan nazikçe pipetleyerek bir hücre süzgeci kapağı (100 μm ağ) olan steril 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Tüpleri sırayla atlıkarınca üzerine koyun.
2. Akış sitometrisi analiz yazılımını açın ve deneysel bir klasör oluşturun. Deneye bir numune ve tüp eklemek için Yeni Numune düğmesine tıklayın ve tüpleri aşağıdaki gibi adlandırın: Tüp 1, Boş; Tüp 2, İzotip IgG1-CD3; Tüp 3, izotip IgG1-CD56; Tüp 4, CD3; Tüp 5, CD56; Tüp 6, CD3CD56.
3. CIK hücre popülasyonları için bir dağılım geçit sistemi oluşturun (Şekil 1A).
   1. Tüp 1'i (Boş) seçin ve bir FSC-A/SSC-A grafiği oluşturmak için Nokta Grafiği düğmesine tıklayın. Hücre kalıntılarını dışlamak için FSC-A eşiği >5 x 10⁴ ile tüm hücre popülasyonunun üzerine dikdörtgen bir kapı çizin.
   2. Yeni nokta çizimi için SSC-A/SSC-H parametresini seçin ve tüm tek hücrelerin etrafına bir çokgen kapısı çizin. Yeni histogram grafiği için sırasıyla Count/FITC (CD3) ve Count/APC (CD56) parametrelerini seçin. Yeni nokta grafiği için FITC (CD3)/APC (CD56) parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört kadranlı bir geçit çizin.
   3. Her numunedeki 20.000 tek hücreden gelen verileri kaydedin. Önce Boş denetim örneğini analiz etmek için Örnek Yükle düğmesine tıklayın. CD56 ve CD3 kanal parametrelerini kullanarak tüm CIK hücre popülasyonunu tanımlayın.
4. Tüm örneklerin incelenmesi için adım 3.3'ü tekrarlayın.
5. CIK hücre popülasyonlarını analiz etmek için tek tek numunenin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın ve bunları analiz dosyalarına yeniden yazdırın.

Sonuçlar

Şekil 1: Temsili bir PBMC örneğinden alınan CD3⁺CD56⁺ T hücrelerinin oranı.(A) Lenfositler belirli büyüklük ve taneciklik ile tanındı. Akış sitometrisi ile analiz için seçilen tek hücre popülasyonu. (B) Üç sağlıklı donörden alınan CIK genişleme etkinliğinin istatistiksel analizi bir t-testi kullanılarak yapıldı (*, p < 0.01).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
APC Fare Anti-İnsan CD56 antikoru	Bd	555518	B159
APC Fare IgG1, κ İzotip Kontrolü	Bd	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Akış Sitometresi	Bd	338962	SN: R33896202856
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Medium/F12	HyClone (Klon	SH30023.02	OC-3 hücre kültürü için bazal ortam
Fetal sığır serumu	HyClone (Klon	SH30084.03	K562 ve OC-3 hücre kültürü için. Komple besiyeri, FBS'nin %10'unu içerir
Ficoll-Paque Artı	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	71101700-EK	Yoğunluk gradyan çözümü
FITC Fare Anti-İnsan CD3 antikoru	Bd	555332	UCHT1
FITC Fare IgG1, κ İzotip Kontrolü	Bd	555748	MOPC-21
İnsan anti-CD3 mAb	Takara	T210	OKT3 50 mL İndüksiyon ortamına 2,5 mL stok (1 mg / 1 mL) ekleyin. -80 °C'de depolama stoğu
RPMI1640 orta	Gibco (Gibco)	11875-085	K562 hücre kültürü için bazal ortam. 4 °C'de depolama stoğu

Serisi Serisi ) ) Serisi Serisi