$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Farelerde Antijenik Spesifik CD8+ T Hücrelerinin Evlat Edinme Transferi
- Yeşil floresan proteini (OTI-GFP) veya kırmızı floresan proteini (OTI-RFP) eksprese eden ovalbümin (OVA) spesifik CD8+ T hücrelerini (OTI) T hücresi reseptörü transgenik farelerin lenf nodu süspansiyonundan bir fare CD8 + T hücresi izolasyon kiti kullanarak izole edin üretim talimatlarına göre. Daha önce tarif edildiği gibi bir şırınga pistonu kullanarak lenf düğümlerini parçalayarak hücre süspansiyonunu hazırlayın.
- OTI-GFP veya OTI-RFP hücrelerini (3 x 106 hücreli), Cahalan ve ark. tarafından tarif edildiği gibi intravenöz enjeksiyon yoluyla C57BL / 6 vahşi tip fare alıcılarına aktarın. Tipik olarak 6-12 haftalık fareleri kullanın.
not: Bu adım isteğe bağlıdır ve yalnızca antijene özgü CD8 + T hücrelerinin izlenmesi için gereklidir.
2. Listeria monocytogenes Enfeksiyonu
- OVA'yı (LM-OVA) eksprese etmek için genetik olarak modifiye edilmiş L. monocytogenes'i, daha önce tarif edildiği gibi OD600 0.08-0.1'e ulaşana kadar hafif ajitasyon altında 37 ° C'de et suyu kalp infüzyonunda üstel bir büyüme fazına genişletin.
- 29 G insülin şırıngası kullanılarak intravenöz enjeksiyonla fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyreltilmiş 100 μL (maksimum hacim = 200 μL) 0.1–0.5 LD50 LM-OVA'yı, belirtildiği zaman OTI-GFP veya OTI-RFP hücreleri taşıyan C57BL / 6 vahşi tip fare alıcılarına enjekte edin.
not: Elimizde 0.1 x LD50 LM-OVA, 2 x 104 koloni oluşturan birime (CFU) karşılık gelir. OVA'yı eksprese etmek için genetik olarak modifiye edilmiş L. monocytogenes, daha önce transfer edilen OTI CD8 + T hücrelerini aktive etmek için kullanılır, ancak L. monocytogenes'in diğer suşları da kullanılabilir.
3. Sitokin Sekresyonunu Bloke Etmek için Brefeldin A (BFA) ile Tedavi
- 29 G insülin şırıngası kullanarak fare sadrazından önce 6 saat boyunca intraperitoneal olarak 200 μL PBS'de 250 μg BFA enjekte edin.
not: Liyofilize BFA, 25 mg / mL konsantrasyonda bir stok hazırlamak için önce dimetil sülfoksit (DMSO) içinde yeniden süspanse edilir. BFA daha sonra enjeksiyondan önce kristalleşmeyi önlemek için oda sıcaklığında (RT) PBS içinde seyreltilir. Sitokin sekresyonunun inhibisyonu, hücrelerde IFNγ birikimine neden olur. Bu, sitokin tespiti için çok önemlidir.
4. Dalağın Toplanması
- Fareleri artan COkonsantrasyonları kullanarak ötenazi yapın 2 ve ardından servikal çıkık yapın.
not: Farelerin insancıl ötenazisi için yerel kurum yönergelerini izleyin.
- Karnı% 70 etanol ile temizleyin ve dalağın bulunduğu farenin sol tarafındaki deriden 1-2 cm'lik bir kesi yapmak için makasla bir kesi yapın. Dalağı ortaya çıkarmak için peritonda dikkatlice bir kesi yapın ve cımbızla çıkarın. Dalak mimarisini bozmamak için forseps ile sıkmamaya veya kesmemeye dikkat ederek dalağı hasat edin.
5. Dalağın Paraformaldehit (PFA) ile Fiksasyonu
- 3.75 mL PBS ve 3.75 mL 0.2 M L-lizin karıştırarak fiksatif çözeltiyi hazırlayın. 21 mg sodyum m-periodat ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra 2.5 mL% 4 PFA ve 20 μL 12 N NaOH ekleyin.
not: Fiksatif solüsyonu aynı gün kullanın ve fazlalığı atın. Saklamayın. Bu fiksasyon adımı, numunenin GFP gibi floresan proteinleri içermesi durumunda önemlidir. Floresan proteinleri denatüre ettiği için eser miktarda metanol içeren PFA kullanmayın.
Dikkat: PFA toksiktir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.
- Dalağı fiksatife batırın ve hafif çalkalama altında en az 4 saat, tipik olarak 4 ° C'de 16-20 saat sabitleyin.
- Fiksatif çözeltiyi atın ve hafif çalkalama altında RT'de 5 dakika boyunca 5 mL PBS ekleyin.
- PBS'yi 5 mL taze PBS ile değiştirin ve hafif çalkalama altında 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- PBS'yi 5 mL% 30 sükroz ile değiştirin ve 12-24 h.
için inkübe edin
not: Bu yöntem doku morfolojisinin korunmasına yardımcı olur. Sükroz çözeltisi ile inkübasyondan sonra, organ kuyu dibine batmalıdır.
6. Dondurma ve Kesit Alma
- Kuru buzu büyük bir kaba koyun ve içine yaklaşık 50 mL saf metanol ve birkaç parça kuru buz içeren daha küçük bir kap yerleştirin.
- Dalağı tüy bırakmayan bir mendille nazikçe kurulayın.
- Dalağı, altta bir damla optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği içeren bir taban kalıbının içine yerleştirin. Herhangi bir baloncuk oluşturmamaya dikkat edin. Dalağın üzerine OCT ekleyin.
- Forseps ile, baz kalıbı metanolün yüzeyine bırakın ve OCT'ye temas etmediğinden emin olun. Artefaktları en aza indirmek için dokuyu mümkün olduğunca çabuk dondurmak.
- Donduğunda, bölümleme ile devam edin.
not: Donmuş dalak -80 °C'de birkaç ay saklanabilir.
- Dokuyu bir kriyo-mikrotom kullanarak bölümlere ayırın.
- Kriyostat üzerindeki hazne sıcaklığını -21 °C'ye ayarlayın. İstenilen kalınlıkta (genellikle yaklaşık 10 μm) bölümleri kesin. Bu protokol 30 μm'ye kadar kalınlıklarda çalışır.
- Kesitleri cam mikroskop slaytları üzerine toplayın (Malzeme Tablosuna bakın) ve görsel olarak inceleyin.
not: Bölümler birkaç ay boyunca -80 ° C'de tutulabilir.
7. İmmünofloresan Boyama
- Bölümün RT'ye gelmesine izin verin.
- Doku bölümünün etrafına sıvı engelleyici (örneğin PAP kalemi) ile bir daire çizin. OCT'nin dışına çizin yoksa yapışmaz.
- Kuruduktan sonra, PBS'yi doku bölümüne 5 dakika boyunca yerleştirerek numuneyi yeniden sulandırın< >
not: Bölüme konulan hacim, bölümün boyutuna bağlıdır. Genellikle 100-300 μL kullanırız. Bölümlerin yeniden sulandırıldıktan sonra kurumasına izin vermeyin.
- Bölümün slayta iyi yapıştığından emin olmak için PBS ile en az iki kez durulayın.
- Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için bölüme bir bloke edici çözelti ekleyin.
- Blokaj solüsyonunu aşağıdaki gibi hazırlayın:% 0.1 Triton X100,% 2 fetal buzağı serumu (FCS),% 2.5 μg / mL Fc reseptör blokeri (anti-fare CD16 / 32) içeren PBS. Daha sonra, boyama panelinin her bir ikincil antikorunun türünün% 2-5'ini normal serumu ekleyin.
not: Antikorlar doğrudan konjuge / biyotinile edilmişse, her bir primer antikorun türünün% 5 normal serumunu ekleyin. Bir birincil antikor ve ikincil antikorlardan biri aynı türden ise (örneğin, tavşanda yükseltilmiş birincil antikor ve ikincil tavşan anti-sıçan), arka plan sinyalini artıracağı için normal serum türlerini kullanmayın.
- PBS'yi aspirasyon ile bölümden nazikçe çıkarın ve numune bölümü başına 100 μL bloke edici solüsyon ekleyin. RT'de en az 1 saat kapalı bir ıslak odada inkübe edin.
- Primer antikorlarla boyayın.
- Birincil antikorları, bloke edici çözeltideki optimal konsantrasyonda seyreltin. Genel başlangıç noktası antikor konsantrasyonu 5 μg/mL'dir, ancak her antikor ve doku için optimize edilmelidir.
not: Antikorlar doğrudan konjuge ise, antikor karışımını kullanmadan önce 17.135 x g'da (13.500 rpm) 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Floroforlar çökelebilir. Bu adım, çökeltileri toplayacak ve böylece çökelmiş antikorların slayt üzerinde spesifik olmayan birikimini önleyecektir.
- Bloke edici çözeltiyi her numune için birincil antikor karışımı ile değiştirin.
- RT'de 4 saat veya gece boyunca (OVN) 4 ° C'de kapalı bir ıslak odada inkübe edin.
- Yıkama yapın.
- PBS'ye %2 FCS ekleyerek Yıkama Tamponunu hazırlayın.
- Yıkama tamponu ile 4 kez yıkayın: biri hızlı (inkübasyon olmadan), biri 10 dakika ve ikisi 5 dakika. Ardından PBS ile 5 dakika boyunca son bir yıkama yapın.
- İkincil antikorlarla boyama.
- İlgilenilen ikincil antikorları, bloke edici çözeltideki optimal konsantrasyonda seyreltin. Karışımı, birincil antikorlar için tarif edildiği gibi santrifüjleyin.
- Son yıkama solüsyonunu çıkarın. İkincil antikor karışımını bölümün üstüne ekleyin ve kapalı bir ıslak odada RT'de 1-4 saat inkübe edin.
- Yıkama tamponu ile 4 kez yıkayın: biri hızlı (inkübasyon olmadan), biri 10 dakika ve ikisi 5 dakika. Ardından PBS ile 5 dakika boyunca son bir yıkama yapın.
- Son yıkama solüsyonunu çıkarın. PBS'nin buharlaşmasına izin verin, ancak bölümü aşırı kurutmayın. Numunenin üzerine bir damla montaj ortamı yerleştirin ve kapak camını dikkatlice üzerine yerleştirin. Montaj ortamı tüm bölümü kurtarmalıdır. Işıktan korunan RT'de polimeraz OVN'ye izin verin.
not: Montaj ortamını uygulamadan önce sürgünün arka tarafındaki bölümün etrafına bir daire çizin. Montaj ortamı uygulandıktan sonra, dokunun görülmesi zorlaşabilir.
- Slaytları görüntü almaya hazır olana kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
8. Görüntüleme ve Analiz
- Boyamanın görüntülemesini konfokal mikroskop ile gerçekleştirin.
not: Bu protokolde, 10x/NA 0.40 veya 60x/NA 1.4 (sitokin sub-hücre lokalizasyonunun analizi için) objektifleri ile birlikte ters çevrilmiş bir spektral lazer tarama mikroskobu kullanıldı (bkz. Malzeme Tablosu). Malzeme Tablosundaki her bir florofor ve floresan proteini için uyarma ve emisyon dalga boyları görüntülenir.
- Görüntü işleme yazılımı (örneğin, Imaris veya Fiji) kullanarak gerektiği gibi analiz ve miktar tayini gerçekleştirin.