Murin Tam Kanından Trombositlerin Saflaştırılması ve Aktivasyonu

Özet

Kaynak: Narciso, M. G., et al. Fare Kanından Trombositlerin Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, murin tam kanından trombositlerin saflaştırılması ve ardından trombosit agonisti trombin ile aktivasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. Akış sitometrisi ile analiz edildiğinde, saflaştırılmış dinlenme trombositleri, hücre yüzeyi markörü CD41'in ekspresyonuna dayalı olarak karakterize edilirken, saflaştırılmış aktive edilmiş trombositler, hem yüzey markörleri CD41 hem de CD62P'yi birlikte eksprese eder.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Trombosit Saflaştırma

NOT: Trombosit saflaştırması, bozulmalarını önlemek için oda sıcaklığında yapılmalıdır. Reaktiflerin ve aletlerin sıcaklığının 18 ila 22 °C arasında olduğundan emin olun. Trombosit bozulmasını önlemek için işlem sırasında hızlı pipetleme ve kuvvetli çalkalamadan kaçınılmalıdır.

1. 1,5 mL'lik bir tüpe 600 μL iohexol gradyan ortamı (%0,85 sodyum klorür içinde %12 iohexol tozu, 5 mM Trisin, pH 7,2) ekleyin.
2. 200 μL kan örneğini tüpün yanından aşağıya, geniş delikli bir pipet ucu ile gradyan ortamının üzerine yavaşça ekleyin, böylece kan ve iohexol ortamı karışmaz (Şekil 1A).
3. Tüp içeren numuneyi 400 x g'da 20 ° C'de 20 dakika boyunca yavaş hızlanma ve yavaşlama ile sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyin.
4. Trombositten zengin tabakanın çoğunu ve trombositten fakir tabakanın küçük bir kısmını (toplam 300 ila 400 μL) geniş delikli bir pipet ucu kullanarak RBC ve WBC tabakalarını bozmadan toplayın (Şekil 1B). Trombosit örneğini yeni bir tüpe aktarın.
   not: Eğer kanda trombosit sayısı az ise ya da daha az hacimde kan kullanılıyorsa trombositten zengin tabaka ile trombositten fakir tabaka tek bir tabaka olarak görülebilir.
5. Trombosit örneğine 1 mL PBS ekleyin, ters çevirerek karıştırın ve sallanan bir kova rotorunda 20 ° C'de 10 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Solüsyonu tamamen atın ve hafif pipetleme ile trombositleri yeniden süspanse etmek için 200 μL PBS ekleyin.
   not: Bu adım, gradyan ortamını ve plazma proteinlerini uzaklaştırdığı ve trombositlerin trombin gibi agonistlere duyarlılığını artırdığı için isteğe bağlıdır. Farklı santrifüjler farklı programlara sahip olduğundan, yavaş hızlanma/yavaşlama, santrifüjün kullanım kılavuzu okunarak belirlenebilir.
6. Trombositleri saymak için bu numunenin 30 μL'sini yeni bir tüpe aktarın. Kalan trombositler, trombosit aktivasyonu, agregasyon, granül salınımı vb. gibi biyokimyasal ve fizyolojik testler için kullanılabilir.
7. RNA veya protein ekstraksiyonu için, trombositleri peletlemek için trombosit örneğini 800 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı tamamen atın. Trombositleri parçalamak için istenen hacimde RNA veya protein lizis tamponu ekleyin.

2. Trombosit Aktivasyonu

1. Bir tüpte, 100 μL'ye kadar boyama tamponuna (% 2 fetal sığır serumu ile PBS, FBS) 1 ila 2 milyon saflaştırılmış trombosit ekleyin.
2. Çok sayıda numune için, aşağıdakilerden 1 μL (0.5 mg / mL) içeren bir ana antikor karışımı yapın: PE-Cy7 sıçan anti-fare TER 119, PE sıçan anti-fare CD45, FITC sıçan anti-fare CD41 ve APC sıçan anti-fare / insan CD62P (P-selektin) sırasıyla RBC, WBC, trombositler ve aktive trombositleri tespit etmek için. Hücreleri boyamak için ana karışımı tüplere ekleyin. Trombin eklemeyin.
3. Başka bir tüpte, 100 μL'ye kadar boyama tamponuna 1 ila 2 milyon saflaştırılmış trombosit ve 0.4 mM GPRP peptidi ekleyin. Trombositleri aktive etmek için trombin ekleyin ve adım 2.2.
   izleyerek hücreleri boyayın not: Trombosit aktivasyonu yoluyla agrega veya pıhtı oluşumunu önlemek için trombin eklemeden önce numuneye GPRP eklenmelidir. Trombositlerin iyi bir aktivasyonunu elde etmek için trombin konsantrasyonu optimize edilmelidir. Trombosit aktivasyonundan sonra, akım sitometrisi ile örneklerin alınması sırasında olay sayıları azalır.
4. Pozitif bir kontrol olarak, bir tüpte 100 μL'ye kadar boyama tamponuna ve 0.4 mM GPRP peptidine 1 μL tam kan ekleyin. Trombositleri aktive etmek için trombin ekleyin. Negatif kontrol olarak, 100 μL'ye kadar boyama tamponuna 1 μL tam kan ekleyin. Negatif kontrol örneğine trombin eklemeyin. Adım 2.2'yi izleyerek hücreleri boyayın.
5. Akış sitometrisi izotip kontrolü için 5 tüpü lekesiz, PE-Cy7, PE, FITC ve APC ile etiketleyin. Hücreleri boyamak için etiketli tüplere 100 μL boyama tamponu, 1 μL kan ve 1 μL ilgili antikor ekleyin.
6. Numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca lekelenmek üzere inkübe edin.
7. Her tüpe 1 mL boyama tamponu ekleyerek numuneleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Peleti yerinden çıkarmadan boyama tamponunu dikkatlice atın.
8. Her tüpe 300 μL boyama tamponu ekleyin, hafifçe karıştırın ve bir FACS tüpüne aktarın. Lekeli numuneleri bir akış sitometresi ile analiz edilene kadar karanlıkta saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1. Iohexol gradyan ortamı ile santrifüjlemeden önce ve sonra fare kanı. (A) Kan örneği dikkatli bir şekilde eklenirse, iohexol ve kan santrifüjlemeden önce iki ayrı tabaka oluşturur. Sol panel şematik diyagramı gösterir ve sağ panel gerçek görüntüyü gösterir. (B) Tam kanın gradyan ortamı ile santrifüjlenmesinden sonra dört ayrı tabaka görülür. Sol panel katmanların şematik diyagramını gösterir ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
APC sıçan anti-fare / insan CD62P (P-seçici)	Termo Bilimsel	17-0626-82	Trombosit aktivasyon belirteci
Eppendorf tüpü	Balıkçı Bilimsel	14-222-166	Santrifüj tüpü
Fetal sığır serumu (FBS)	Canlandırıcı	26140079	Boyama tamponu için bileşen
FITC sıçan anti-fare CD41	BD Biyolojik Bilimler	553848	Trombosit işaretleyici
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Kırlangıç	03-34-0001	Trombosit pıhtı oluşumunu önleyin
Pipet uçları 1000 μL, geniş çaplı	ThermoFisher Bilimsel	21-236-2C	Kan ve trombosit örneklerinin aktarılması
PE sıçan anti-fare CD45	BD Biyolojik Bilimler	561087	WBC işaretleyici
PE-Cy7 sıçan önleyici fare TER 119	BD Biyolojik Bilimler	557853	RBC işaretleyici
Pipet uçları 200 μL, geniş çaplı	ThermoFisher Bilimsel	21-236-1A	Kan ve trombosit örneklerinin aktarılması
Fosfat tamponlu salin (PBS)	ThermoFisher Bilimsel	14040-117	Yıkama ve seyreltme için tampon
Boyama tamponu	House	Katalog dışı ürün	Yıkama ve seyreltme tamponu
Trombin	Enzim Araştırma Laboratuvarı	HT 1002a	Trombosit aktivasyon agonisti
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	S7653 Serisi	Fizyolojik tuzlu su
Masa üstü santrifüj	ThermoFisher Bilimsel	75253839/433607	Sallanan kova rotor santrifüjü
Trisin	Sigma-Aldrich	T0377	Nycodenz ortamı için tampon
FACS tüpü	Balıkçı Bilimsel	352008	Akış sitometrisi için tüpler

Gazetesi Gazetesi Serisi