Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Besiyerinin, Enzim Çözeltilerinin ve Hayvanların Hazırlanması
- 1 g iyotu 100 ml etanol içinde çözerek% 1 iyot alkolü hazırlayın.
- Her biri 7.5 ml D-glikoz (100 g / L) ve 5 ml 100x Penisilin / Streptomisin stok çözeltisi (15 mg / ml D-glikoz, 50 U / ml Penisilin ve 50 μg / ml Streptomisin finali) ile takviye edilmiş Ca2 + ve Mg2 + içermeyen 2x 500 ml Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (PBS) hazırlayın.
- 1x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ortamını 5 ml 100x Penisilin / Streptomisin stok çözeltisi (50 U / ml Penisilin ve 50 μg / ml Streptomisin finali) ile takviye edin.
- 9.9 ml PBS'ye 25 mg Tripsin ve 0.1 ml DNaz I (1 mg / ml DNaz I) ekleyerek bir Tripsin-DNaz I çözeltisi (2.5 mg / ml Tripsin ve 10 μg / ml DNaz I) hazırlayın.
- Tripsin inhibitörü A çözeltisi (10 mg / ml) için 50 mg Tripsin inhibitörünü 5 ml PBS'de çözün. Tripsin inhibitörü B çözeltisi (2.5 mg / ml) için 25 mg Tripsin inhibitörünü 10 ml PBS'de çözün.
- Bir Kollajenaz-Hyaluronidaz-Deoksiribonükleaz I (DNaz I) çözeltisi için 10 mg Kollajenaz A (1 mg / ml final), 10 mg Hyaluronidaz (1 mg / ml final) ve 0.1 ml DNaz I (1 mg / ml DNaz I) (10 μg / ml final) 10 ml PBS'de.
- 9.9 ml PBS'ye 10 mg Hyaluronidaz (1 mg / ml final) ve 0.1 ml DNaz I çözeltisi (1 mg / ml) (10 μg / ml final) ekleyerek bir Hyaluronidaz-DNaz I çözeltisi hazırlayın.
- Wistar farelerini, Sertoli hücre izolasyonu gününde 19 günlük olacak şekilde zamanında sipariş edin.
not: Açıklanan protokol 10 sıçan için tasarlanmıştır, ancak en az 5 ve en fazla 20 sıçan için değiştirilebilir. Tüm çözümlerin hacimleri buna göre ayarlanmalıdır.
Aşağıdaki protokolde, bir "pipet", serolojik bir pipet anlamına gelir.
2. Seminifer Tübüllerin Hazırlanması
- 10 erkek Wistar sıçanını, CO2 ve dakikada oda hacminin en az% 20'sini değiştiren bir akış hızı kullanarak bir desikatörde tek tek uyuşturun. Solunum durana kadar bekleyin, bir ayak pedi sıkarak anesteziyi test edin ve reaksiyon yoksa her sıçanı servikal çıkık ile ötenazi yapın. Akan su altında juguler ven ve karotis arteri (vagina carotica) kesit alarak kanı boşaltın. Karnı %70 etanol ile silerek dezenfekte edin.
- Forseps kullanarak karın kaslarından cildi kaldırın ve kasık simfizinden sternuma uzanan oval şekilli bir cilt lobunu kesin (Şekil 1A) ve göğsün üzerine yukarı doğru çırpın. Daha sonra, karın kaslarını tutun ve kasık simfizinden sternuma medial bir kesi yapın.
- Testisleri alt pelvisten dışarı itmek için başparmaklarla pelvisten yukarı doğru karın bölgesini sıkın. Testisi daha fazla yukarı çekmek için epididimal yağ pedini (Şekil 1B) forseps ile seçin. Spermatik kordonu kesin (Şekil 1B), tunika albuginea'yı sağlam bırakın ve tüm testisleri 50 ml'lik konik bir tüpte 20 ml PBS'de toplayın (Şekil 1C).
- Tüm testisleri topladıktan sonra, etanole eşit hacimde (20 ml)% 1 (a / h) iyot ekleyerek dezenfekte edin. Tüpü iki kez ters çevirin ve süpernatanı hemen boşaltın. Testisleri her biri 25 ml PBS ile iki kez hızlı bir şekilde yıkayın (Şekil 1D).
- Testisleri 15 ml PBS içeren bir Petri kabına aktarın (Şekil 1E). Her testisi bir ucundan forseps ile sıkıca kavrayın, diğer uçta tunika albuginea'ya küçük bir kesi yapın ve kazıma aleti olarak kapalı makas bıçakları kullanarak tübülleri sıkın.
not: Tübüller, homojen enzimatik sindirimi sağlamak için çözeltiye uzanan sadece birkaç tübül ile kompakt testis şeklinde bir demet oluşturmalıdır (Şekil 1F).
- Dekapsüle testisleri 10 ml Tripsin-DNaz I çözeltisi içeren 100 ml'lik vidalı kapaklı bir şişeye aktarın. Parçalama işlemini 32 °C'de (120 salınım/dk) çalkalanan bir su banyosunda gerçekleştirin. 4 dakika sonra, tübüllerin dağılması için tübülleri çıplak gözle değerlendirin. Tübüller çözelti içinde dağılmaya başladığında, sindirimi hemen durdurun. Gerekirse, inkübasyona 2 dakikaya kadar devam edin.
- 5 ml tripsin inhibitörü çözeltisi A ekleyerek tripsin sindirimini durdurun. 10 ml'lik bir pipet kullanarak 3-4 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek çözeltiyi iyice karıştırın ve 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın.
- 5 dakikalık inkübasyondan sonra, tübüllerin birim yerçekimi ile çökelmesini gözlemleyin, adım 2.6'dan 10 ml'lik pipeti kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve tripsin sindirimini tamamen durdurmak için 10 ml tripsin inhibitörü B çözeltisi ekleyin. 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek tübülleri yeniden süspanse edin.
- Kirletici interstisyel hücreleri çıkarmak için, tübülleri her biri 25 ml PBS ile 9 kez yıkayın. Her yıkamada 25 ml'lik bir pipet kullanarak tübülleri yeniden askıya alın ve 10 dakika boyunca birim yerçekimi ile çökmelerine izin verin. PBS'yi pipetlemek, yeniden askıya almak ve süpernatantın çıkarılması için her zaman aynı 25 ml pipeti kullanın.
3. Peritübüler Hücrelerin (PTC'ler) Çıkarılması/İzolasyonu
- Tüm tübülleri 100 ml'lik vidalı kapaklı bir şişeye aktarın ve Kollajenaz-Hyaluronidaz-DNaz I çözeltisini ekleyin (Şekil 2A). 32 ° C'de (120 salınım / dak) çalkalanan bir su banyosunda 10 dakika boyunca sindirim yapın.
- Bir cam slayt üzerine bir damla süspansiyon pipetleyin ve 100x büyütmede rutin hücre kültürü için tübülleri ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında hızlı bir şekilde kontrol edin. Sindirim yeterince ilerlemiş değilse, 2 dakika daha inkübasyona devam edin (mikroskobik kontrol için gereken süreyi saymayın).
not: Bu adım sırasında tüm tübüllerin uzunluğu kısalır ve tübül kenarları pürüzlü hale gelmelidir (Şekil 2B ve C). Pürüzlü kenarlar, peritübüler hücrelerin salınmasının göstergesidir.
- Sindirilmiş tübüllerle süspansiyonu, adım 2.8'deki 25 ml'lik pipeti kullanarak 50 ml'lik konik bir tüpe aktarın. 100 ml'lik şişeyi 10 ml PBS ile yıkayın ve konik tüpteki tübüllere ekleyin. Sindirilmiş tübüllerin 10 dakika boyunca birim yerçekimi ile çökelmesine izin verin ve PTC'leri içeren süpernatanı tekrar 25 ml'lik pipeti kullanarak dikkatlice aspire edin ve yeni bir konik tüpe aktarın. Son birkaç mililitrenin aspirasyonu için, tübüllerin taşınmasını önlemek için 5 ml'lik bir pipet kullanın.
4. Sertoli Hücrelerinin (SC'ler) İzolasyonu
- Çökelmiş tübülleri 25 ml'lik bir pipet kullanarak 25 ml PBS'de adım 3.3'ten itibaren iyice yeniden süspanse edin ve 12 dakika boyunca birim yerçekimi ile çökelmelerine izin verin. PBS'yi pipetlemek, tübüllerin yeniden süspansiyonu ve süpernatantların uzaklaştırılması için aynı 25 ml'lik pipeti kullanın. Yıkamayı 3 kez tekrarlayın (toplam 4 yıkama).
- Son yıkamadan sonra, sindirilmiş tübülleri Hyaluronidaz-DNase I solüsyonu içeren 100 ml'lik başka bir vidalı kapaklı şişeye aktarın. Parçalama işlemini 32 °C'de (120 salınım/dk) çalkalanan bir su banyosunda gerçekleştirin.
- 5 dakika sonra, adım 3.2'de açıklandığı gibi 100X büyütmede hafif mikroskobik inceleme ile tübülleri tekrar kontrol edin.
not: Kısa tübüller, tübüler agregalar ve salınan hücreler görünür olmalıdır (Şekil 2D).
- Boru şeklindeki agregaların 10 dakika dinlenmesine izin verin ve süpernatanı 25 ml'lik bir pipet kullanarak aspire edin. Agregaları 25 ml PBS kullanarak 4 kez yıkayın ve her yıkama adımı için 10 dakikalık bir çökeltme süresi (Şekil 2E).
- 20 ml RPMI 1640 ortamı ekleyin ve süspansiyonu 20 ml'lik bir şırıngaya monte edilmiş 18 G'lik bir iğneden 10 kez geçirin. Hava kabarcıklarından kaçının.
not: Süspansiyonun iğneden içeri ve dışarı çekilmesi tek geçiş olarak kabul edilir. Hücrelerin hidrodinamik kesme ile parçalanması ve homojenleştirilmesi, toplanma eğiliminde olan hücrelerin hazırlanmasında standart bir tekniktir. Hücrelerin küçük iç çaplı hipodermik bir iğneden geçmesinin, fonksiyonel özellikleri üzerinde bir etkisi olması olası değildir. Şekil 3C ve D, kültürün 4. gününde saflaştırılmış Sertoli hücrelerinin normal üst yapısını göstermektedir.
- Bir cam slayt üzerine bir damla süspansiyon pipetleyin ve agregaların tümü dağılmışsa, 10X büyütmede rutin hücre kültürü için ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında tübülleri hızlı bir şekilde kontrol edin (Şekil 2F). Süzüntüde saf tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
- Adım 4.4'ün süzüntüsünü 200 x g'da RT'de 10 dakika boyunca mola kullanmadan santrifüjleyin. Süpernatanı 25 ml'lik bir pipet kullanarak dikkatlice aspire edin ve Sertoli hücrelerini 40 ml RPMI 1640 ortamında (serumsuz) yeniden süspanse edin.
- 100 μl hücre süspansiyonunu 100 μl Tripan Mavi Leke ile karıştırın ve hücreleri Neubauer Geliştirilmiş hazne ile sayın. Sayım sonucuna göre hücre konsantrasyonunu 3 x 106 hücre/ml olarak ayarlayın. 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 1 ml tohum (= 1. gün). not: Süspansiyondaki Sertoli hücreleri hızlı bir şekilde çöker, bu nedenle pipetle bir hücre alikotu alınmadan önce tüp her seferinde kısaca çalkalanmalıdır. 4. güne kadar alt tabakaya sıkıca yapışırlar.
