İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden CD4+ Vδ1+ γδ T Hücrelerinin Seçici İzolasyonu

Özet

Kaynak: Welker, C., et al. İzolasyon ve Ex Vivo Vδ1⁺CD4⁺γδ T Hücrelerinin Kültürü, Bir Ekstratimik αβT Hücre Progenitör. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu videoda, insan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) düşük konsantrasyonlu CD4⁺Vδ1⁺γδ T hücreleri popülasyonunun manyetik etiketlemeye dayalı izolasyonu için bir protokol gösterilmektedir. FITC konjuge anti-Vδ1 antikorları, manyetik anti-FITC mikro boncuklar ve anti-CD4 antikor kaplı süperparamanyetik boncukların bir kombinasyonu kullanılarak, CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ T hücreleri PBMC popülasyonundan başarılı bir şekilde saflaştırılabilir.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Vδ1 T Hücrelerinin İzolasyonu

1. Vδ1^CD4 T hücrelerinin frekansını belirleyen bir başlangıç FACS'si için <1 x 10 6 izole lenfosit alın.
   not: Bu T hücresi varlığının popülasyon büyüklüğü, bireyler arasında ve immünolojik durumlarına göre büyük farklılıklar gösterebilir. Tipik olarak, T hücrelerinin yaklaşık% 1'i Vδ1 ⁺ ve Vδ1 ⁺ hücrelerinin yaklaşık% 1-5'i CD4 ⁺ 'dır.
   1. Hücreleri,% 2 FCS ve 5 mM EDTA içeren PBS'den oluşan 1 ml FACS tamponu ile seyreltin. 660 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın. Yaklaşık 100 μl FACS tamponunun geri akış hacmi, sonraki boyama için yeterlidir. FACS boyamanın daha fazla özgüllüğü için hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 5 μl Fc-Bloke Reaktif ile kısaca girdaplayın ve inkübe edin.
   2. İnsan monoklonal antikorlarını, Fc-Bloke Reaktifini çıkarmadan doğrudan hücrelere ekleyin. Hücreleri Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1:200), CD8 (1:200) ve TCRαβ (1:25) antikorlarıyla boyadığınızdan emin olun. İzotip kontrolünü karşılık gelen immünoglobulin izotipleri ile hazırlayın. Hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika boyunca antikorlarla inkübe edin.
   3. Hücreleri 1 ml FACS tamponunda yıkayın (2 dakika santrifüjleyin; 660 x g'da), süpernatanı boşaltın ve kalan tampon hacminde FACS alımına devam edin.
2. Hücreleri (FACS analizinde kullanılmayan) 12 dakika santrifüjleme ile peletleyin; 300 g'da; 8 °C'de. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 1 x 10⁷ hücre başına 60 μl MACS tamponunda yeniden süspanse edin. 1 x 10⁷ hücre başına 20 μl Fc Bloke Reaktif ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
3. 1 x 10⁷ hücre başına 10 μl FITC konjuge anti-insan Vδ1 antikoru doğrudan hücrelere ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 12 dakika inkübe edin.
4. Hücreleri 14 ml MACS tamponu kullanarak yıkayın (12 dakika santrifüjleyin; 300 g; 8 ° C'de). Süpernatanı tamamen atın ve hücreleri 1x10⁷ hücre başına 80 μl MACS tamponunda yeniden süspanse edin.
5. 1-2 x 10⁵ hücre alın ve FACS analizi ile etiketlemenin doğrulanması için bunları 100 μl FACS tamponunda seyreltin. Bu adım için başka katkı maddesine gerek yoktur. Vδ1^- ve Vδ1⁺ hücreleri için parlaklıkta yeterli bir fark olduğundan emin olun. Aksi takdirde, 1.3 ve 1.4 adımlarını tekrarlayın.
6. Kalan hücrelere 1 x 10⁷ hücre başına 20 μl anti-FITC mikro boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri en az 10 ml MACS tamponu kullanarak yıkayın (300 x g; 8 ° C'de 12 dakika santrifüjleyin).
7. Santrifüjleme sırasında, bir mıknatıs içine yerleştirilmiş önceden soğutulmuş manyetik sütunu 500 μl MACS tamponu ile dengeleyin.
8. Hücreleri 500 μl MACS tamponunda yeniden süspanse edin (1 x 10^8'den büyük hücre sayıları için bu hacmi uygun şekilde ölçeklendirin) ve hücreleri sütuna dikkatlice uygulayın. Vδ1^- hücrelerini içeren akışı toplayın.
9. Kolonu 500 μl MACS tamponu ile üç kez yıkayın ve akışı tekrar aynı tüpte toplayın. Kolona tampon uygulamadan önce rezervuarın boş olması gerektiğini unutmayın.
10. Sütunu manyetik cihazdan çıkarın ve 15 ml'lik konik bir tüpe yerleştirin. Pistonu kolona sıkıca iterek kolonu 1 ml MACS tamponu ile hızlı bir şekilde yıkayın. Elüatı bir tüpte toplayın.
    NOT: %>98'lik bir saflık elde etmek için genellikle 1.7-1.9 adımlarını ikinci bir sütunla tekrarlamak gerekir.
11. Daha önce olduğu gibi aynı antikor paneli ile FACS analizi ile hücrelerin saflığını doğrulayın (bkz. 1.1.2) ve hücreleri sayın.

2. Vδ1CD4⁺ T Hücrelerinin İzolasyonu

1. 25 μl CD4 boncuklarını >30 saniye boyunca bir girdapla yeniden süspanse edin. Boncukları (üretici tarafından gösterilen minimum miktar) 1.5 ml'lik bir reaksiyon tüpünde 1 ml MACS tamponunda 1 dakika boyunca bir mıknatısa yerleştirerek yıkayın. Süpernatanı küçük ölçekli bir pipetle (200 μl) dikkatlice atın ve boncukları orijinal MACS tamponu hacminde yeniden süspanse edin.
2. Vδ1⁺ hücrelerini peletleyin (12 dakika santrifüjleyin; 300 x g'da) ve süpernatanı aspire edin ve tüm Vδ1⁺ hücrelerini 500 μl MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve bunları boncukları içeren tüpe ekleyin. Kuvvetlice karıştırın ve sabit eğme ile (örneğin bir döndürücüde) 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
3. Hücreleri içeren tüpü 2 dakika boyunca bir mıknatısın içine yerleştirin. Kapakta kalıntı olmadığından emin olun.
   NOT: CD4 ⁺ hücreleri manyetik boncukları bağlayacak ve tüpün mıknatısa bakan tarafına yapışacaktır.
4. Tüpü manyetik cihazın içinde tutarken kapağı dikkatlice açın ve küçük ölçekli bir pipet kullanarak CD4-Vδ1⁺ hücrelerini içeren süpernatanı toplayın. CD4-Vδ1 ⁺ hücrelerini ayrı bir tüpe yerleştirin ve popülasyondan muhtemelen kalan CD4 hücrelerini veya boncukları önlemek için bu tüpü tekrar mıknatısa yerleştirin.
   1. CD4^- hücrelerini 5 ml MACS tamponunda yıkayın (12 dakika santrifüjleyin; 300 x g'da) ve 100 μl ortam başına 1 x 10⁵ hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. CD4^- hücreleri uygun koşullar altında kolayca yetiştirilebilir.
5. CD4 ⁺ hücre hedeflerinin bulunduğu tüpü manyetik alanın dışına yerleştirin, hücreleri 500 μl MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve manyetik cihaza geri koyun. Daha yüksek bir saflık elde etmek için 2.3-2.5 adımlarını iki kez tekrarlayın. Süpernatanı pipetleyerek çıkarın.
6. CD4 ⁺ hücrelerini 100 μl kültür ortamında (RPMI 1640,% 10 FCS,% 1 L-Glutamin,% 1 Penisilin / Streptomisin) yeniden süspanse edin ve 10 μl'lik bir boncuk ayırma çözeltisi ekleyin. Sabit eğme ile (örneğin, bir döndürücüde) RT'de 45 dakika inkübe edin.
7. Hücreleri 1 dakika boyunca bir mıknatısa yerleştirin. Küçük ölçekli bir pipet kullanarak boncuk içermeyen Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ hücreleri içeren süpernatantı dikkatlice toplayın.
8. Mıknatısın dışında, boncukları 100 μl kültür ortamı ile yeniden süspanse edin ve daha yüksek CD4 ⁺ hücre sayıları elde etmek için 2.6 ve 2.7 adımlarını iki kez tekrarlayın.
9. Hücreleri peletleyin (300 x g'da 12 dakika santrifüjleyin) ve süpernatanı pipetleme ile tamamen atın. Hücreleri taze, önceden ısıtılmış ortamda yeniden süspanse edin ve sayın. Adım 1.1.1-1.1.3'te gösterilen FACS analizi ile Vδ1⁺CD4⁺ hücrelerinin saflığını inceleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su	Sigma Aldrich	D8537
MACS arabelleği	Miltenyi Biyotec	130-091-222	BSA ile takviye edin ve kullanmadan önce ön soğutun
Bsa	Miltenyi Biyotec	130-091-376	bu tedarikçiden zorunlu olarak değil
insan karşıtı Vd1 FITC (klon: TS8.2)	Termo Bilimsel	TCR2730	bu tedarikçiden zorunlu olarak değil
anti-insan CD3 PerCP (klon: SK7)	BD Biyolojik Bilimler	345766	bu tedarikçiden veya bu florokromdan zorunlu olarak değil
anti-insan TCRab PE (klon: T10B9.1A-31)	BD Biyolojik Bilimler	555548	bu tedarikçiden veya bu florokromdan zorunlu olarak değil
insan karşıtı CD4 VioBlue (klon: MT466)	Miltenyi Biyotec	130-097-333	bu tedarikçiden veya bu florokromdan zorunlu olarak değil
anti-insan CD8 APC-H7 (klon: SK1)	BD Biyolojik Bilimler	641400	bu tedarikçiden veya bu florokromdan zorunlu olarak değil
Anti-FITC MultiSort Kiti	Miltenyi Biyotec	130-058-701	anti-FITC MicroBeads'ten daha iyi sonuçlar verir
MS sütunları	Miltenyi Biyotec	130-042-201	Kullanmadan önce önceden soğutun
MiniMACS Ayırıcı	Miltenyi Biyotec	130-042-102
CD4 Pozitif İzolasyon Kiti	Yaşam Teknolojileri	11331D