İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzakları Oluşturmak için İn Vitro Teknik

Özet

Kaynak: Najmeh, S., et al. Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzakları (NET'ler) İzolasyonu ve İşlenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşturmak ve izole etmek için kullanılan bir in vitro teknik gösterilmektedir. Nötrofiller periferik kandan izole edilir ve NET üretmek için forbol miristat asetat (PMA) ile uyarılır. İnkübasyon sırasında, nötrofiller, granüler sitoplazmik proteinlerle karıştırılmış yoğunlaştırılmış kromatin içeren NET'leri serbest bırakmak için bir hücre ölümü (NETosis) sürecinden geçer.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. NET Oluşturma

1. Nötrofilleri 500 nM PMA (30 ml nötrofil çözeltisi başına) ile uyarın ve 37 ° C'de% 5 CO_2'de 4 saat boyunca 20 mm'lik bir ızgaraya sahip 150 x 25 mm'lik düz doku kültürü kabı üzerinde inkübe edin. Bu, NETosis'e izin verecektir.
2. 4 saatlik stimülasyondan sonra, ortamı nazikçe aspire edin ve atın, NET ve nötrofil tabakasını altta yapışmış halde bırakın. Bu katmanı bozmayın.
3. Tabak başına Ca ve Mg içermeyen toplam 15 ml soğuk PBS kullanarak, alttaki tüm yapışkan materyali çıkarmak için her tabağın altını 15 ml PBS pipetleyerek yıkayın.
4. Her bir bulaşığın (adım 1.3) 15 ml'lik konik bir tüpte yıkanmasından elde edilen çözeltiyi toplayın ve 4 ° C'de 450 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. Nötrofiller ve kalan hücreler altta topaklanacak ve hücresiz NET açısından zengin bir süpernatan bırakacaktır.
5. Süpernatanı 1.5 ml'lik mikro santrifüj tüplerine bölün ve 4 ° C'de 18.000 x g'da 10 dakika döndürün. Bu, tüm DNA'nın peletlenmesine izin verecektir.
   not: Normal santrifüjde bu kadar yüksek hızlara ulaşılabiliyorsa, daha büyük tüplerde santrifüjleme daha kolay ve daha az zaman alıcıdır, aksi takdirde yüksek hızlı mikro santrifüj kullanmak için süpernatanları daha küçük tüplere bölmek gerekecektir.
6. Süpernatanı atın ve buz gibi soğuk PBS'de birlikte elde edilen tüm peletleri, 100 μl PBS başına 2 x^{10 7} nötrofile karşılık gelen bir konsantrasyona yeniden süspanse edin. Bu, sonraki deneyler için kullanılabilecek hücresiz NET stoğunu verecektir.
7. Spektrofotometri veya alternatif bir DNA niceleme aracı kullanılarak elde edilen numunedeki DNA konsantrasyonunu ölçün. Numunedeki yeterli konsantrasyon 140 - 180 ng/μl arasında olmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (PBS), Modifiye, kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermez	avrupa bizonu	311-425-CL
RPMI-1640 L-glutamin içeren Orta	avrupa bizonu	350-000-CL	% 3 RPMI çözeltisi, RPMI'nin% 3 Fetal Sığır serumu ile takviye edilmesiyle yapılır
Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)	Sigma-Alrdrich	P8139 Serisi
Fetal Sığır Serumu (FBS)	avrupa bizonu	080-150
20 mm ızgaralı (150 x 25 mm) entegre doku kültürü kabı	doğan	353025

arası