Murin Diş Bloklarından Dişeti İmmün Hücre Ağının İzolasyonu

Özet

Kaynak: Dutzan, N. et al., Dişeti İmmün Hücre Ağının İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Fonksiyonel İncelemesi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, bir fare modelinden dişeti bağışıklık hücresi ağının izolasyon prosedürünü göstermektedir. Enzimatik sindirim, diş eti dokusunu bağlı dişlerden ve kemikten serbest bırakır, bu da mekanik olarak daha fazla sindirilir ve diş etinden bağışıklık hücrelerini serbest bırakır. İzole edilen hücreler immünolojik deneyler için hazırdır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Önceden Hazırlanın

1. Komple ortam hazırlayın: 2 mM L-glutamin, 100 ünite/ml penisilin, 100 ug/ml streptomisin ve %10 FBS ile desteklenmiş RPMI.
2. DNase ortamını hazırlayın: 7,5 μg DNaz ile desteklenmiş 50 ml RPMI ortamı (Taze yapın, her zaman buz üzerinde tutun).
3. Kollajenaz-DNaz ortamını hazırlayın: 5 ml DNaz ortamı artı 3.2 mg / ml Kollajenaz Tip IV (Taze yapın, her zaman buz üzerinde tutun).
4. Santrifüjü 4 °C'ye önceden soğutun.
5. Çalkalayıcı inkübatörü 37 °C'ye kadar ısıtın.

2. Dişeti Bloklarından İzolasyon, Diseksiyon ve Hücre İzolasyonu

1. Fareleri, Hayvan Araştırmaları Danışma Komitesi (ARAC) yönergelerine göre uygun bir odada CO_2'ye maruz bırakarak ötenazi yapın.
2. Kalbi ve iç organları ortaya çıkarmak için göğüs ve karın boşluğunu açın. Perfüze etmek için, inferior vena kavada bir insizyon yapın ve 27 G'lik bir iğne ile 3 ml'lik bir şırınga kullanarak sol ventrikül yoluyla 3 ml PBS perfüze edin.
3. Farenin gövdesini ve başını, midesi yukarı bakacak şekilde bir ped üzerinde hareketsiz hale getirin.
4. Dudağın boynuna doğru her bir komiseri, mandibula ve boyun bölgesini kaplayan cildi ayırarak ve alttaki doku ve kasları açığa çıkararak makasla kesin. Mandibulayı ortaya çıkarmak için alt dudağı inceleyin.
5. Mandibulanın her iki tarafını ayırmak için alt kesici dişler arasında kesin ve ağız boşluğuna erişmek için her iki tarafı hareketsiz hale getirin.
6. Damağı burun boşluğundan uzakta görselleştirin ve inceleyin.
7. Alanları 10 bıçaklı bir bıçak kullanarak inceleyin ve çevreleyen dişeti ile maksiller ve mandibular molar alanları dahil edin (Şekil 1). Birinci azı dişinin hemen önünde ve üçüncü azı dişinin hemen önünde dikey kesiler ve diş etinin sınırında (dişleri çevreleyen dokunun beyaz yakalı) yatay bir kesi yapın.
8. Maksiller ve mandibular blokları 5 ml Kollajenaz / DNaz içeren 50 ml'lik konik bir tüpe yerleştirin (buz üzerinde tutun).
1
9. saat boyunca 37 ° C'de bir çalkalayıcı inkübatörde inkübe edin ve inkübasyonun son 5 dakikasında 50 μl 0.5 M EDTA ekleyin.
10. Mendillerle birlikte 50 ml'lik tüpe 5 ml soğuk DNaz ortamı ekleyin ve karıştırmak için hafifçe döndürün.
11. 4 blok dokuyu bir petri kabına aktarın ve üzerlerini 500 μl DNaz ortamı ile kaplayın. Bir neşter bıçağı kullanarak ve bıçağı diş eti ve diş arası bölgelere doğrultarak her bir doku bloğundan diş etini çıkarın.
12. Dokuları ve ortamı petri kabından ve diseksiyon sırasında kullanılan önceki DNaz ortamından hücre süzgeci (70 μm boyutunda) aracılığıyla 50 ml'lik yeni bir tüpe aktarın. Kullanılan tüm aletleri DNase besiyeri (3-5 ml) ile yıkayınız ve süzün.
13. Steril 3 ml'lik bir şırınganın pistonunu kullanarak, dokuyu süzgecin üzerine ezin, soğuk DNaz ortamı (30 ila 35 ml) ile süzün.
14. Hücre süzgecini soğuk DNaz ortamı ile yıkayın.
15. 4 ° C'de, 314 x g'da 6 dakika santrifüjleyin.
16. Süpernatanı atın ve 1 ml tam ortamda tekrar askıya alın.
17. Hücreleri sayın (beklenen miktar, otomatik bir hücre sayacı kullanarak 8 x 10⁵ ila 1.2 x 10⁶ hücre arasında değişmelidir ve canlılığı >%80) olmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1: Murin dişeti izolasyonu. Dişeti dokusu diseksiyonu için kullanılacak maksilla ve izole dişeti segmentindeki diseksiyonun sınırlarını gösteren çizim. (B) Murin maksillasının (molar alan) blok diseksiyonu için bir taslak ve izole blok segmenti. Dişeti dokuları ana hatları çizilmiş bir maksiller molar segmentin hematoksilen ve Eozin boyası (H&E) düşük (C) ve daha yüksek büyütme (D) olarak gösterilir. Orijinal büyütmeler bel...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İnce Makas	Güzel bilim araçları	14058-11
Neşter Sapı #3	Güzel bilim araçları	10003-12
Neşter Bıçakları #10	Güzel bilim araçları	10010-00	steril
Kıymık Forseps	Integra Miltex	6-304
Düzenli eğimli iğneler	BD Medikal	305109	27G, 12,7 mm uzunluk
Monoject şırıngalar	Covid (Türkçe)	8881513934	Luer kilitli uç, 3 mL
PBS, pH 7.4	Yaşam Teknolojileri	10010-049	Kalsiyum ve magnezyum içermez
dev/dak 1640	Fransa	12-167F	L-glutamin içermez
Sığır pankreasından DNaz I	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Kollajenaz tip IV	Gibco (Yaşam teknolojileri tarafından)	17104-019
Fetal Sığır Serumu	Gemini Biyo-ürünleri	100-106
Gentamisin 50 mg / ml	Kaliteli biyolojik	120-098-661 ADET
Kalem Strep	Gibco (Yaşam teknolojileri tarafından)	15140-122
L-Glutamin	Gibco (Yaşam teknolojileri tarafından)	25030-081
0.5M EDTA pH 8.0	Kaliteli biyolojik	351-027-721EA
50 mL tüpler	Corning	352070	Polipropilen, steril
70 μM Hücre Süzgeçleri	Corning	352350
Petri kapları	Corning	351029	steril

arası Gazetesi arası