$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Akciğer Dokusu Örnekleri
>NOT: Akciğer dokusunun in vivo çalışmaları için, ilgili maruziyetten sonra numuneleri inceleyin. Bu deney için en uygun maruziyet, bulaşıcı mikroorganizmalar, özellikle bakterilerdir. Bu yöntem için kullanılabilecek fare suşları, 10-12 haftalık, 25-30 g ağırlığında ve erkekken C57BL/6 veya BALB/c fareleridir.
- İntraperitoneal ketamin (400 mg / kg) ve ksilazin (40 mg / kg) enjeksiyonu yoluyla farelere ötenazi yapın. Göğüs boşluğunu açın ve cerrahi forseps ve makas kullanarak akciğerleri ve kalbi açığa çıkarın.
- Damarlardaki kanı 30 saniye boyunca yıkamak için sağ ventriküle 21 gauge iğne kullanarak ılık PBS'yi infüze edin, ardından 30 saniye boyunca (sağ ventriküle) 10 mL% 2 PLP fiksatifi infüze edin.
- Açık göğüs boşluğunu yıkamak için ılık PBS (42 °C) kullanın. Trakeayı 21 gauge iğne ve boyutuna göre kesilmiş 0,8 mm'lik bir boru parçası ile entübe edin ve 800 μL önceden ısıtılmış (42 ° C'ye kadar), düşük erime noktalı %3 agaroz çözeltisi enjekte edin.
- Trakeayı örgülü ipek (4.0 USP) ile bağlayın. İpliği trakeanın etrafına, kanülün yerleştirme noktasının hemen altına yerleştirin ve basit bir el üstü düğümle sabitleyin. Agarozu katılaştırmak için, akciğerlerin etrafına buz gibi soğuk PBS uygulayın. Hem makas hem de künt diseksiyon kullanarak akciğerleri ve kalbi göğüs boşluğundan bir blok olarak çıkarın. Her akciğeri ayrı ayrı çıkarın ve ardından 4 ° C'de% 2 PLP veya formalin içinde 16 saat boyunca sabitleyin.
- Örnekleri doku kesitine kadar 4 ° C'de PBS'de saklayın.
- Akciğer dokusu örneklerini hazırlamak için aşağıdaki adımları kullanın.
- Akciğer dokularını (adım 1.1'de rezeke edilmiş) oda sıcaklığında 24 saat boyunca% 10 doğal tamponlu formalin içinde sabitleyin. % 75 etanole aktarın ve 12 saatlik bir döngüde bir doku işlemcisine koyun (% 75 EtOH'de 2,5 saat, mutlak EtOH'de 3 saat, çözücü 3B'de 3,5 saat ve parafin içinde 3 saat).
- Oda sıcaklığında saklanan formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü (FFPE) bloklar oluşturmak için standart parafine gömün.
not: Bu aşamada genellikle standart slaytlar için akciğer bölümlerinin kesilmesi uygundur.
- FFPE akciğer bölümlerini bir mikrotom kullanarak 4 - 5 μm kalınlığında kesin ve şarjlı, kaplanmış slaytlara monte edin.
- Kızakları monte etmek için, 60 mm x 24 mm lamellere (boyut 1,5) 3 damla montaj ortamı koyun, lamel üzerindeki sürgüyü ters çevirin ve fazla ortamı dışarı itin. Hermetik olarak oje ile kapatın ve oda sıcaklığında saklayın.
2. Akciğer Dokusu Örneklerinin Hazırlanması/Mikroskobu
- FFPE akciğer dokusu örneğini mumdan arındırmak, yeniden sulandırmak ve antijen alma solüsyonu ile ön işleme tabi tutmak için.
- FFPE slaytlarını 60 °C'de 60 dakika fırında kurutun. Daha sonra slaytları 30 dakika ksilen çözeltisine koyun ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 70 etanol çözeltisine aktarın. Musluk suyunda durulayın.
- Isıya dayanıklı plastik sargıya koyun ve 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9.0'da 10 dakika boyunca düdüklü tencerede HIER-antijen alımına tabi tutun. 20 dakika soğutun. Bir külbütörde 5 dakika boyunca musluk suyunda iki kez, ardından bir külbütörde PBS ile bir kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 BSA / PBS'de% 10 tavuk serumu ile bloke edin.
- Dokuyu boyayın.
- Makrofajlardaki MET'leri tanımlamak için, 1/100 seyreltmede 4 ° C'de 16 saat boyunca% 1 BSA / PBS'de birincil antikorları (MMP-9, H3Cit ve F4 / 80) ekleyin (antikor miktarları ile ilgili spesifik ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir). Bir külbütör üzerinde 5 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 40 dakika boyunca% 1 BSA / PBS'de karşılık gelen ikincil antikorlarla inkübasyon yoluyla floresan tespiti elde edin. Antikorlar şunlardır: (1) tavuk anti-fare 488 (yeşil), (2) tavuk anti-keçi 594 (kırmızı) ve (3) eşek anti-fare 647 (uzak kırmızı).
- Bölümleri PBS'de yıkayın ve kromatin boyama için DAPI içeren bir montaj ortamı ile monte edin.
- Ters çevrilmiş bir mikroskoba bağlı konfokal bir lazer tarama kafası kullanarak floresan görüntüler elde edin.
- 405, 488, 561 ve 647 nm lazerlerle hazırlığı heyecanlandırın. 20X 0,1 NA hava ve 40X 1,0 NA yağ objektifi kullanarak satır sıralı, seviyelendirme düğmesine (2 satır ortalaması) tıklayarak tek düzlemli 512 x 512 piksel görüntüler yakalayın.
- Her sonuç için analiz ve veri için bölüm başına en az on görüş alanı elde edin (yani, kontrol için 10 yüksek güçlü görüş alanı (HFOV), uyarılmış numune için 10, vb. her fare için).
not: Tüm alanın temsili bir örneğini elde etmek için, alanın farklı bölümlere ayrıldığı bir matris sistemi kullanılabilir ve her farklı örnek için görüş alanlarını seçmek için aynı matris kullanılır (örneğin, alan 9 bölüme ayrılabilir ve merkezden ve 4 köşeden, iki HFOV alınır).