$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
NOT: Yöntemin şematik akışı Şekil 1'de açıklanmıştır.
1. Malzeme hazırlama
NOT: Tüm reaktifleri steril bir kapüşonda aseptik olarak hazırlayın ve belirtilen sıcaklıkta saklayın. Reaktifler, etkilerini kaybetmeden 2 yıla kadar saklanabilir.
- 20 mg / mL Mycobacterium tuberculosis içeren CFA'yı aşağıda tarif edildiği gibi hazırlayın.
- 7 mL'lik bir tüpe 100 mg dondurularak kurutulmuş M. tuberculosis H37RA (Malzeme Tablosuna bakınız) ve beş adet 3,2 mm çelik boncuk ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Tüpü bir homojenizatörde (Malzeme Tablosuna bakın) en yüksek hız ayarında (5.000 rpm) 60 s çalkalayın.
- Tüpe 5 mL eksik Freund adjuvanı (IFA) ekleyin ve en yüksek hızda 60 saniye boyunca tekrar çalkalayın. IFA'daki homojenize M. tuberculosis bulamacını (şimdi CFA olarak adlandırılmaktadır) bir pipetle taze bir tüpe aktarın, boncukları geride bırakın ve kullanılana kadar 4 ° C'de saklayın.
- 10 mg / mL'lik bir nihai peptit konsantrasyonu elde etmek için dondurularak kurutulmuş MOG35-55 peptit tozuna (Malzeme Tablosuna bakınız) ultra saf su ekleyin. Solüsyonu 0,2 μm'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin. 60 μL'lik alikotlar hazırlayın ve kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
not: Bu deney için kullanılan MOG35-55 peptidi, ImmunoGrade saflığındadır (~% 70), TFA ile bölünür, suda kolayca çözünür ve in vivo stabiliteyi artırmak için bir C-terminal amid (-NH2) içerir. Peptit alikotları hiçbir zaman çözülmedi ve iki defadan fazla yeniden dondurulmadı ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklandı.
2. CFA/peptit emülsiyonlarının hazırlanması
- Bağışıklama için gereken emülsiyon miktarını hesaplayın. Bu standart protokolde, her fareye 50 μg MOG35-55 peptid ve 300 μg M. tuberculosis Freund adjuvanında (CFA) dağılmıştır. Emülsiyonların hazırlanması için gereken her bir reaktifin (MOG35-55 peptit, PBS, CFA ve IFA) miktarı, Ek Dosya 1 kullanılarak hesaplanabilir. Küçük emülsiyon kaybını telafi etmek için tüm reaktiflerin ek %20'si hesaplamaya dahil edilir.
not: Bu çalışmada kullanılan ticari emülsiyon kiti (Malzeme Tablosuna bakınız), sterilize edilmiş bir poşet içinde bir tüp, vidalı kapak ve bir piston içerir. Emülsiyon kitinin her bir tüpü maksimum 9.6 mL içerir, bu da 40 fareyi (veya hayvan başına 100 μL emülsiyon kullanılıyorsa 80 fareyi) aşılamak için yeterli 8 x 1 mL şırınga hazırlamayı mümkün kılar.
- Vidalı kapaklı tüpü (ticari emülsiyon kitinden itibaren) ve kullanılacak reaktifleri buz üzerine yerleştirin.
- Emülsiyon bileşenlerini adım 2.1'de hesaplanan hacimlerde aşağıdaki sırayla ekleyin: PBS, daha sonra peptit, daha sonra CFA'da M. tuberculosis ve son olarak IFA.
- Tüpü birkaç kez sıkarak ve gevşeterek kapakla sıkıca kapatın. Reaktifleri önceden karıştırmak için tüpü elle 5-10 s kuvvetlice çalkalayın.
- Tüpü çalkalama homojenizatörüne yerleştirin ve çubukla sabitleyin. Hızı en yüksek ayara ve süreyi 60 saniyeye ayarlayın. Çalışma bittiğinde, tüpü 3 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Çalıştırmayı aynı ayarlarla bir veya iki kez daha tekrarlayın.
- Sıkışan havayı çıkarmak ve emülsiyonu sıkıştırmak için tüpü 300 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Kapağı tüpten çıkarın, pistonu tüpe yerleştirin ve emülsiyonun tepesine ulaşana kadar yavaşça aşağı doğru itin. Tüpün altındaki geçmeli kapağı çevirerek çıkarın.
- Pistonu bir enjeksiyon şırıngasından çıkarın (1 mL; Malzeme Tablosuna bakınız). Enjeksiyon şırıngasına bir iğne (tercihen 25-27 G) ekleyin.
- Enjeksiyon şırıngasının arka ucunu tüpün altındaki özel kilide takın ve kısa bir bükülme ile kilitleyin.
- Pistonu hafifçe iterek emülsiyonu tüpten enjeksiyon şırıngasına aktarın. Emülsiyon, enjeksiyon şırıngasının 0.15 mL derecesine ulaştığında durun.
- Enjeksiyon şırıngasını tüpten ayırın ve şırıngaya hava girmemesine dikkat ederek pistonu dikkatlice yerleştirin. Emülsiyon iğneden çıkana kadar pistonu itin.
not: Bu noktada, emülsiyonun bir kısmı kalite kontrol için kullanılabilir (bkz. adım 3).
- Tüpte bulunan emülsiyonun geri kalanı için 2.8-2.11 adımlarını tekrarlayın.
not: Pahalı CFA / antijen emülsiyonlarının israfını en aza indirmek için 1 mL şırıngalar kullanılmalıdır. Tüpün altındaki özel kilide uyan diğer şırıngalar kullanılabilir; Bununla birlikte, daha büyük bir emülsiyon hacminin hazırlanması gerekebilir. CFA/MOG35-55 peptit emülsiyonu, EAE indükleme kapasitesini kaybetmeden 4 ° C'de 15 haftaya kadar saklanabilir.
3. Emülsiyonun kalite kontrolü
- Düşme testi: 20 mL soğuk su ile doldurulmuş steril 50 mL konik bir tüpe küçük bir damla emülsiyon ekleyin. Tüpü kapatın ve birkaç saniye elinizle sallayın. Küçük farklı damlacıkların görünümü, yağda su emülsiyonunun oluşumunu doğrular.
- Faz kontrast mikroskobu kullanarak emülsiyonu inceleyin.
- Yağdaki su parçacıklarının boyutunu analiz etmek için, bir mikroskop lamına küçük bir damla (2-3 μL) emülsiyon ekleyin, bir kapak kayması ile sürün ve ardından emülsiyonu düzleştirmek için dairesel hareketlerle sertçe itin.
- Bulaşmış emülsiyonu 400x büyütmeli bir faz kontrast mikroskobu altında (Malzeme Tablosuna bakınız) inceleyin ve emülsiyonun tek tabakası olan bir alana odaklanın. Küçük tek tip gri/beyaz parçacıkların görünür olduğundan emin olun (Şekil 2A).
