Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Fare Hazırlığı
NOT: Hayvan hazırlama ve ameliyatı da dahil olmak üzere aşağıdaki prosedür 30-40 dakika sürecektir. Ameliyattan önce mikroskobu açın ve kapalı kuvözü mikroskop üzerinde 37 °C'ye ısıtın.
- Bernard Malissen'den (INSERM, Paris, Fransa) elde edilen C57BL / 6 arka planında 8-10 haftalık TcrdEGFP fareleri üzerinde deneyler yapın. IACUC onaylı prosedüre göre, hayvanın ağırlığına bağlı olarak ketamin (120 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) enjeksiyonu ile fareyi uyuşturun. Anestezi seviyesini solunum hızı (dakikada 55-65 nefes), ayak parmağı tutamağı ve palpebral refleks ile değerlendirin.
- Cerrahi düzlem anestezisine ulaşıldığında, vücut ısısını korumak için farenin arka bacaklarını bir rektal termometre ile izlenebilen bir ısıtma yastığına bant kullanarak sabitleyin. Anestezinin yıprandığına dair işaretler varsa (ör., solunum hızının artması, göz kırpma ve / veya palpebral reflekse göz kası seğirme yanıtı), fare tamamen sakinleşene kadar bir seferde 50 μL ketamin / ksilazin uygulayın.
- Nükleer boyayı 50 μL Hoechst 33342 (10 mg / mL) 315 μL% 0.9 salin ile seyrelterek hazırlayın; nihai konsantrasyon, farenin ağırlığına bağlı olarak 37.5 mg / kg'dır (200 μL yaklaşık hacim). Fare uyuşturulduktan sonra, Hoechst'i retro-orbital venöz sinüs boyunca bir tüberkülin şırıngası kullanarak yavaşça enjekte edin.
NOT: Farenin retroorbital enjeksiyonu takiben dolaşım hacmindeki değişikliğe alışmasını sağlamak için bir sonraki adıma geçmeden önce 1-2 dakika bekleyin.
- Kurumasını önlemek için gözlerin üzerine az miktarda kayganlaştırıcı sürün.
2. Fare Cerrahisi: Bağırsak Mukozasını Açığa Çıkarmak için Laparotomi
- Görüntülenecek bağırsak bölgesini dışsallaştırmak için alt karın bölgesinin orta hattı boyunca deri ve periton boyunca 2 cm'lik dikey bir kesi yapın.
- Açılı forseps kullanarak, çekumu periton boşluğundan dikkatlice dışarı çekin ve görüntülenecek ince bağırsak alanını belirleyin. Bu işlem sırasında mezenterik kan damarlarını yırtmamaya dikkat edin. Olası hasarı veya kanamayı en aza indirmek için, bağırsağı forseps ile tutmaktan veya sıkıştırmaktan kaçının.
- Minimal dışkı içeriği içeren görüntüleme için ince bağırsağın uygun bir bölgesini (2-3 cm) bulun. Çek ve kalan ince bağırsağı dikkatlice periton boşluğuna geri koyun, ilgilenilen segmenti dışsallaştırırken.
NOT: Bu adım sırasında çekumu delmekten veya mezenterik vaskülatürü bozmaktan kaçının.
- Alttaki mezenterin her iki tarafına kan damarları arasına iki çift forseps yerleştirin ve zarda bir delik oluşturmak için forsepsin uçlarını hafifçe ovalayın (Şekil 1). Bu, bağırsağın altındaki periton boşluğunu kapatırken iğnenin mezenterden geçmesine izin verecektir.
- Bağırsağın halkasını dışsallaştırırken kesiyi kapatın. Açılı forseps ve 5 cm'lik bir dikişe bağlı kavisli, konik uçlu bir iğne kullanarak, peritonun bir tarafına nüfuz edin, önceki adımda açılan delikten geçin ve periton astarının diğer tarafından yukarı doğru ilerleyin. Bir sütürü insizyonun üst kısmına, diğerini de insizyonun altına yakın bir yere yerleştirin.
NOT: Bu adım sırasında damar sistemine zarar vermekten kaçının.
- Bağırsak halkasının altındaki cildi kapatmak için, alttaki peritondaki önceki dikişlerin arasına, insizyonun ortasına bir dikiş yerleştirerek bu işlemi tekrarlayın.
NOT: Yalnızca görüntülenecek alanı dışsallaştırmak önemlidir; Bu, görüntüleme sırasında yabancı hareketi azaltacaktır. Mezenterik arterleri bağlamaktan kaçındığınızdan emin olun.
- Anti-mezenterik sınır boyunca bir perforasyon hattı yapmak için bir elektrokoter kullanın. Koterizasyondan hemen sonra, ısıya bağlı ek doku hasarını önlemek için bağırsak yüzeyine birkaç damla su uygulayın. Kalan suyu çıkarmak için bir Kimwipe ile kurulayın.
- Vannas makası kullanarak koterize dokunun distal kenarında küçük bir yatay yarık kesin ve mukozal yüzeyi ortaya çıkarmak için koterize çizginin uzunluğu boyunca eksternalize doku segmentinin proksimal ucuna (yaklaşık 1,5 cm uzunluğunda) doğru kesmeye devam edin.
NOT: Gerekirse, açıkta kalan mukozal yüzeyde kalan fazla dışkı içeriğini nazikçe çıkarmak için forseps kullanın.
- Dokunun susuz kalmasını önlemek için farenin karnını nemli bir Kimwipe ile örtün. Fareyi kapalı bir kapta mikroskoba taşıyın.
3. Eğirme Diski Konfokal Mikroskobu ile Görüntü Elde Etme
- HBSS'de 1 μL 1 μM AlexaFluor 633'ü 35 mm'lik bir kabın cam kapaklı tabanına pipetleyin. Fareyi, açılan mukozal yüzey doğrudan lamel ile temas edecek şekilde konumlandırın.
- Mikroskobun başını geriye doğru eğin ve fareyi önceden ısıtılmış bir inkübatörde görüntüleme tablasındaki lamel tabağının üzerine yerleştirin. Alternatif olarak, vücut ısısını korumak için fareyi bir ısıtma battaniyesi ile örtün.
- Görüntüleme yazılımını başlatın. Her lazer için uyarma yoğunluğu ve maruz kalma süresi, fotoağartmayı önlemek ve zaman noktaları arasındaki aralığı en aza indirmek için sırasıyla 10-15 mW veya 120-150 ms'yi geçmemelidir. Kare ortalamasını "2" olarak ayarlayın ve arka plan gürültüsünü azaltmak için EM kazanç işlevini açın. Piksel boyutunun doğru ölçümünü sağlamak için 63x objektif kalibrasyonunu seçin.
NOT: Yukarıda ayrıntıları verilen ayarlar bir ilk referans sağlamak içindir, ancak bireysel mikroskop konfigürasyonlarına bağlı olarak değişecektir.
- 405 nm lazer ve 20x hava objektifini kullanarak, gözle fark edilir bir hareket olmayan veya gözle kayan bir villus alanını bulmak için çekirdekleri görselleştirin. Solunum, peristaltizm veya kalp atışı nedeniyle yapay hareket alanlarından kaçının.
- XY taramasını kullanarak, ilgilenilen alanın XY koordinatını kaydedin ve gliserol daldırma 63X hedefine geçin.
- 405 nm kanalında 1 dakikaya kadar canlı bir görüntü elde ederek seçilen alandaki villusların stabil olduğunu onaylayın.
- 405 nm kanalında canlı bir görüntü elde ederken, villöz ucun hemen altındaki ortogonal düzlemi bulmak için odağı ayarlayın. Villöz uç epitelinin hemen altından başlayarak, 1,5 μm'lik bir adım kullanarak yaklaşık 15-20 μm'lik çekirdekleri çözmek zor olana kadar Z-yığınları elde edin.
NOT: Yukarıda açıklanan pozlama sürelerini kullanarak üç kanalla (405, 488, 640 nm) görüntüleme yaparken, üç kanalı da yaklaşık 20 sn aralıklarla sırayla elde etmek mümkündür.
- Görüntü kararlılığını ve γδ IEL motilitesini doğrulamak için alıma başladıktan 3-5 dakika sonra yazılımı analiz modunda açın. Her villus alanı için 30-60 dakika boyunca görüntü almaya devam edin. Her fare için 2-3 alan kaydedin. Görüntüleme sırasında fareyi her 5 dakikada bir izleyin.
