$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. LMP'lerin Üretimi ve Karakterizasyonu
NOT: Kontaminasyonu önlemek için, bu deneyde kullanılan tüm malzemelerin steril veya otoklavlanmış olduğundan emin olun. Aksi belirtilmedikçe, RT'deki tüm adımları steril koşullar altında biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirin.
- Milletvekillerinin Teşviki ve Toplanması
- 37 ° C'lik bir su banyosunda 10 milyon CEM T hücresinin bir kısmını çözün. 15 ml'lik steril bir tüpte X-VIVO gibi 10 ml önceden ısıtılmış serum içermeyen hematopoietik ortamda seyreltin ve 200 g x 5 dakikada santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 5 ml'lik önceden ısıtılmış bir ortamda yeniden süspanse edin.
- Hücreleri, X-VIVO gibi 15 ml önceden ısıtılmış hematopoietik ortam içeren bir T75 doku kültürü şişesine (süspansiyon hücreleri için) aktarın ve %5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 4 gün inkübe edin.
- 4 gün sonra, tüm kültür ortamını ve hücreleri 100 ml taze ortam içeren bir T175 doku kültürü şişesine aktarın. Hücreleri, 2 milyon hücre / ml yoğunluğa ulaşana kadar aynı koşullar altında yaklaşık 72 saat inkübe etmeye devam edin.
- Hücreleri, her biri 150 ml taze ortam içeren dört T175 şişesi arasında eşit olarak bölün ve hücreler 2 milyon / ml yoğunluğa ulaşana kadar (yaklaşık 48 saat inkübasyon) hücre kültürüne devam edin.
- Her şişeden hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme ile toplayın ve 2 milyon / ml hücre yoğunluğunu korumak için 300 x 106 hücreyi 150 ml taze ortam içeren yeni bir T175 şişesine yeniden süspanse edin.
- Ortama 0.5 μg / ml'lik bir nihai konsantrasyonda aktinomisin D (2 mg / ml'de DMSO içinde çözülmüş) ekleyin ve 24 saat inkübe edin.
- Tüm kültür ortamını 50 ml'lik konik tüplere aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 750 x g'da döndürün. Süpernatanı 50 ml'lik konik tüplere aktarın ve büyük hücre parçalarını çıkarmak için 15 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı 250 ml'lik bir şişeye aktarın ve 50 dakika boyunca 12.000 x g'da ultrasantrifüj edin. Süpernatanı atın ve peletleri toplayın.
- LMP'lerle zenginleştirilmiş peletleri 40 ml steril PBS ile 50 ml'lik bir tüpte 12.000 x g'da 50 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
- Son yıkama süpernatantını toplayın; araç kontrolü olarak kullanılacaktır. LMP peletlerini 1 ml PBS'de süspanse edin ve bunları 1.5 ml'lik steril bir mikrotüpe aktarın. İzole LMP'leri -80 °C'de ayırın ve saklayın (birden fazla serbest çözülme döngüsünü önlemek için).