$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Antijene özgü CD8 + T Hücrelerini Hazırlanmış Nanopartikül Yapay Antijen Sunan Hücrelerle Zenginleştirin.
- CD8 + T hücrelerini izole edin.
- İzoflura maruz bırakarak hayvanları ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın.
- Dalak ve lenf düğümlerini vahşi tip C57BL / 6j farelerden çıkarın ve bunları bir PBS çözeltisine yerleştirin. Organları yumuşatın ve hücreleri, sık sık PBS yıkamaları ile steril bir 70 μm hücre süzgecinden geçirin.
- CD8+ T olmayan hücreleri ortadan kaldırmak için, dokunmatik olmayan bir CD8+ T hücre izolasyon kiti kullanın ve üreticinin talimatlarına uyun.
NOT: Her antijen durumu en az 3 x 106 CD8 + T hücresi gerektirir.
- CD8 + T hücrelerine bağlanmak için nanopartikül aAPC'leri ekleyin.
- İzolasyonu takiben,% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA ile PBS'de 100 μL'lik bir hacme konsantre olun.
- Her 106 CD8+ T hücresi için 1011 aAPC'ye bağlı, peptit yüklü MHC-Ig oranına göre hesaplama yaparak eklenecek aAPC sayısını belirleyin.
- aAPC partiküllerini ve CD8 + T hücrelerini steril 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpte sürekli karıştırma ile 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- CD8 + T hücrelerini elüte etmek ve kültürlemek için takviye edilmiş ortam ve T hücresi büyüme faktörü (TCGF) hazırlayın.
- Takviye edilmiş ortam için, 1x esansiyel olmayan amino asit, 1 mM sodyum piruvat, 0.4x vitamin çözeltisi, 92 μM 2-merkaptoetanol, 10 μM siprofloksasin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile tam RPMI 1640 ortamını (glutaminli) destekleyin.
- TCGF yapmak için belirlenmiş protokolleri takip edin.
not: TCGF, T hücrelerinin büyümesi için gereken ek stimülasyon sinyallerini sağlamak için gerekli olan insan bağışıklık sitokinlerinin kurum içi bir kokteylidir. TCGF, IL-2, IL-7 veya IL-15 gibi bilinen T hücresi uyarıcı sitokinleri ile değiştirilebilir; bununla birlikte, her biri T hücresi yanıtını buna göre polarize edebilir.
- aAPC ve CD8 + T hücre karışımını yıkayın ve zenginleştirin.
- Manyetik parçacık aAPC'lerini, önce %0,5 BSA ve 2 mM EDTA'lı PBS tamponu kullanarak, ikincisi takviye edilmiş ortam kullanarak ve üçüncü olarak %1 TCGF ile takviye edilmiş ortam kullanarak yıkayın.
- aAPC'leri ve zenginleştirilmiş CD8+ T hücrelerini %1 TCGF ile 500 μL takviye edilmiş ortamda elute edin.
- Hücreleri, 2.5 x 105 CD8 + T hücresi / mL konsantrasyonda% 1 TCGF ile takviye edilmiş ortamın oyuğu başına 160 μL'de 96 U tabanlı bir plakada bir hemositometre ve plaka kullanarak sayın.
- Yüzeyde sadece peptit yüklü MHC-Ig bulunan aAPC'ler kullanılarak izole ediliyorsa (yardımcı uyarıcı sinyal yok), ardından Adım 4.5'i tamamlayın. Yüzeyde hem peptit yüklü MHC-Ig hem de yardımcı stimülatör sinyaller ile aAPC'ler kullanılarak izole ediliyorsa, Adım 5'e geçin.
- Yüzeydeki ko-stimülatör sinyallerle kaplanmış manyetik parçacıkları zenginleştirilmiş fraksiyona ekleyin ve T hücrelerinin yüzeyindeki uyarıcı sinyalleri birlikte kümelemek için bir manyetik alan ekleyin.
- Zenginleştirilmiş fraksiyonlara, parçacık üzerindeki peptit yüklü MHC-Ig sayısına bir eşmolar (veya uygulamaya bağlı olarak daha büyük-kontrol edilecek aAPC özellikleri hakkındaki bölüme bakın) uyarıcı antikor ekleyin.
- Ko-uyarıcı manyetik parçacıkların 4 ° C'de 1 saat boyunca zenginleştirilmiş CD8 + T hücrelerine bağlanmasına izin verin.
- Kültür plakasını 1,9 cm (0,75 inç) uzunluğunda iki neodimyum N52 disk mıknatısı arasına yerleştirerek bir manyetik alan ekleyin.
not: N52 disk mıknatısları son derece güçlü bir alana sahiptir. Kültür plakalarına koyarken birbirlerinden çıkarmak zor olduğundan, her ikisini de mıknatıslar arasında ara parçalarla saklamaya özen gösterilmelidir. Mıknatısların inkübatörün metal bileşenlerine yapışmasını en aza indirmek için, bunları hem altta hem de üstte 50 mL konik tüp Strafor kaplara yerleştirin.
2. Hazırlanmış Nanopartikül Yapay Antijen Sunan Hücrelerle Antijene Özgü CD8+ T Hücrelerini Genişletin ve Tespit Edin
- aAPC'ler ve CD8+ T hücreleri içeren 96 U tabanlı kuyucuklu plakayı nemlendirilmiş% 5 CO2, 37 ° C inkübatörde 3 gün boyunca ekleyin. 3. günde, hücreleri% 2 TCGF ile takviye edilmiş ortamın kuyusu başına 80 μL ile besleyin ve 7. güne kadar inkübatöre geri koyun.
- 7. günde, uyarılmış hücreleri saymak için 5 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe toplayın.
- Tüm çözelti hasat edildikten sonra, hasat edilen hücreleri% 0.05 sodyum azid ve% 2 FBS ile 0.5 mL PBS'de yeniden süspanse etmek için döndürün. Tripan mavisi ile boyayarak ve bir hemositometreye güvenerek canlı hücreleri sayın.
- Antijene özgü boyama için 50.000-500.000 sayılan hücreyi iki yeni 5 mL yuvarlak tabanlı tüpe çıkarın. Bir tüp, aynı kökenli peptit-MHC boyası için kullanılacak ve diğer tüp, arka plan boyamasını belirlemek için aynı kökenli olmayan leke için kullanılacaktır.
- % 0.05 sodyum azid ve% 2 FBS ile% 2 FBS'de% 0.05 sodyum azid ile 100 μL PBS'de ilgili soydaş ve aynı kökenli olmayan tüplere 1 μg biyotinillenmiş MHC-Ig ekleyin. allofikosiyanin (APC) konjuge sıçan anti-fare CD8a, klon 53-6.7 (1: 100 seyreltme oranı) 4 ° C'de 1 saat boyunca.
- İkincil streptavidin ve canlı ölü leke ekleyin. Fazla biyotinile MHC-Ig'yi santrifüjleme yoluyla PBS ile yıkayın. Daha sonra tüm numuneleri 1:350 oranında fikoeritrin (PE) etiketli streptavidin ve 1:1000 oranında canlı/ölü sabitlenebilir yeşil ölü hücre boyası ile 4 ° C'de 15 dakika boyunca boyayın.
- Antijene özgü hücrelerin özgüllüğünü ve sayısını belirlemek için bir akış sitometresindeki tüm örnekleri okuyun.
- Santrifüjleme ile fazla ikincil ve canlı/ölü lekeleri yıkayın ve bir akış sitometresinde okumak için %0.05 sodyum azid ve %2 FBS içeren 150 μL PBS tamponu ile yeniden süspanse edin.
- Veri analiz yazılımı ile antijene özgü hücrelerin sayısını ve yüzdesini belirleyin.
- Antijene özgü hücrelerin yüzdesini belirlemek için, aşağıdaki kapıları sırasıyla kullanın: canlı+, lenfosit+ (yan saçılma ile ileri saçılma), CD8+ ve Dimer+. Aynı kökenli olmayanı aynı kökenli lekeyle karşılaştırarak Dimer+ kapısını belirleyin.
- Bir numunedeki antijene özgü hücrelerin yüzdesini, aynı kökenli MHC-Ig boyasının Dimer+ yüzdesini, aynı kökenli olmayan MHC-Ig boyasından çıkararak belirleyin.
- Antijene özgü hücrelerin bu yüzdesini kullanarak, sayılan hücre sayısıyla çarpın, zenginleştirme ve genişlemeden kaynaklanan antijene özgü hücrelerin sayısını elde edin.
not: Bu panelde kullanılan floroforlarla spektral örtüşme olduğu için akış sitometresinde kompanzasyon ayarlanmalıdır.